血管平滑肌細(xì)胞在自發(fā)性高血壓大鼠頸動(dòng)脈重構(gòu)中的作用及替米沙坦的干預(yù)效果

血管平滑肌細(xì)胞在自發(fā)性高血壓大鼠頸動(dòng)脈重構(gòu)中的作用及替米沙坦的干預(yù)效果

國(guó)內(nèi)外科學(xué)家對(duì)sas血管重建（shr）的主要關(guān)注焦點(diǎn)是小型動(dòng)脈炎、動(dòng)脈炎、腎動(dòng)脈炎和腸系膜動(dòng)脈，但對(duì)頸部動(dòng)脈重建的報(bào)道很少。近年隨著對(duì)高血壓發(fā)病機(jī)制的深入研究,證實(shí)頸動(dòng)脈是高血壓的重要靶器官之一,其損害與預(yù)后密切相關(guān)。高血壓所致的頸動(dòng)脈病變(重構(gòu))日益受到重視。血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的改變是SHR血管重構(gòu)的主要內(nèi)容,對(duì)SHR頸動(dòng)脈重構(gòu)中VSMCs變化包括VSMCs的增生(增殖或肥大)和凋亡等方面的研究報(bào)道很少。替米沙坦是血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體拮抗劑,其對(duì)SHR頸動(dòng)脈重構(gòu)影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文報(bào)道VSMCs的增殖、肥大及凋亡在SHR頸動(dòng)脈重構(gòu)中的作用及替米沙坦的干預(yù)作用。1材料和方法1.1大鼠性別、周齡和年齡的測(cè)定30只12周齡雄性SHR大鼠,體重250~300g,隨機(jī)分為3組:高血壓組(SHR)、替米沙坦高劑量組(TelH)、替米沙坦低劑量組(TelL),另設(shè)同性別、周齡的10只WKY大鼠為對(duì)照組。大鼠均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,合格證號(hào):SCXK(滬2003-0003);12h光照/黑暗,飲用冷開(kāi)水,自由攝食進(jìn)水。1.2特效藥替米沙坦由德國(guó)勃林格殷格翰公司惠贈(zèng)。1.3胞死亡檢測(cè)試驗(yàn)鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(α-SMA,克隆號(hào):1A4,即用型)、鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA,克隆號(hào):PC10,即用型)購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(insitucelldeathdetectionkit,POD)購(gòu)自Roche公司,0.25%胰蛋白酶、免疫組化試劑盒(SP-9000)、顯色劑(AEC和DAB)購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。大鼠血壓心率測(cè)定儀(RBP-1B型,北京中日友好醫(yī)院臨床研究所),顯微鏡(OlympusBX41,日本),計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(Image-ProPlus,Version:4.5,MediaCybernetics,Inc,USA),電子天平(FA2004型,上海天平儀器廠)。1.4方法1.4.1替米沙坦胃被調(diào)劑al每日8:00替米沙坦高劑量組(TelH)、替米沙坦低劑量組(TelL)分別給予替米沙坦8mg/(kg·d)-1、0.8mg/(kg·d)-1溶于2ml蒸餾水中灌胃,SHR組及WKY組予2ml蒸餾水灌胃。18周后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。1.4.2頸動(dòng)脈中膜形態(tài)變化的檢測(cè)(1)大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)定大鼠于40℃預(yù)熱15min,用大鼠RBP-1B型大鼠血壓儀測(cè)量大鼠清醒安靜狀態(tài)下尾動(dòng)脈的收縮壓(SBP)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始及之后每?jī)芍軠y(cè)一次血壓。(2)標(biāo)本收集及組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)予以氯胺酮/地西泮混合(75/5mg/kg)腹腔注射麻醉,于頸總動(dòng)脈分叉上0.5cm處剪下左側(cè)頸總動(dòng)脈,予以PBS液沖洗管腔后立即置入10%PBS甲醛固定,取頸總動(dòng)脈分叉處下方0.5cm以下部分,頸總動(dòng)脈分叉下0.5cm處朝上,進(jìn)行垂直石蠟包埋,連續(xù)切片,制成4μm切片。每組每條血管的切片依序取第4~6張行彈力纖維和膠原纖維的雙重染色法(P/VB法)染色。第7~9張,行HE染色。(3)各組大鼠頸動(dòng)脈中膜增生程度測(cè)定在彈力纖維和膠原纖維的雙重染色法(P/VB法)染色的切片,可見(jiàn)內(nèi)、外彈力膜間是血管中膜,在計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)下,隨機(jī)取10處分別測(cè)頸動(dòng)脈中膜厚度,取平均值,同一條血管的3張切片再次取平均值,即為頸動(dòng)脈中膜厚度(MT);測(cè)頸動(dòng)脈外彈力膜圈內(nèi)面積及內(nèi)彈力膜圈內(nèi)面積,中膜橫截面積=外彈力膜圈內(nèi)面積-內(nèi)彈力膜圈內(nèi)面積,同一條血管的3張切片取平均值,即為頸動(dòng)脈中膜橫截面積(MCSA)。(4)中膜細(xì)胞平均核面積測(cè)定用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng),在HE染色下每張切片隨機(jī)取10個(gè)高倍視野,分別測(cè)量中膜細(xì)胞核面積,并分別取平均值,即為中膜細(xì)胞平均核面積。(5)S-P免疫組化染色每組每條血管的切片依序取第10~12張行α-SMA免疫組化染色,第13~15張行PCNA免疫組化染色。嚴(yán)格按說(shuō)明書操作,簡(jiǎn)述如下:切片常規(guī)脫蠟至水化,3%過(guò)氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,α-SMA、PCNA均用微波修復(fù),分別滴加抗體α-SMA、PCNA,置濕盒4℃溫育過(guò)夜,通用型生物素標(biāo)記鼠二抗37℃溫育30min,以上各步驟間用PBS沖洗2min共3次。α-SMA用AEC顯色,陽(yáng)性信號(hào)呈紅色;PCNA用DAB顯色,陽(yáng)性信號(hào)呈棕黑色。鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,蒸餾水中止反應(yīng),蘇術(shù)素復(fù)染。DAB顯色切片經(jīng)酒精脫水,二甲笨透明,中性樹(shù)膠封片;AEC顯色切片用水性封片劑封片。PCNA免疫組化染色每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)平均動(dòng)脈中膜PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占中膜細(xì)胞總數(shù)百分比,即頸動(dòng)脈中膜細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)。(6)原位末端標(biāo)記(TUNEL)法標(biāo)記凋亡細(xì)胞每組每條血管的切片依序取第16~18張,嚴(yán)格按說(shuō)明書操作,簡(jiǎn)述如下:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化,用0.25%胰蛋白酶37℃溫育30min,滴加50μl的TUNEL反應(yīng)混合液,在濕盒中37℃溫育60min,滴加50μl轉(zhuǎn)化劑-POD,在濕盒中37℃溫育30min;以上各步驟間用PBS沖洗2min共3次。用AEC顯色,陽(yáng)性細(xì)胞核呈紅色。鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,蒸餾水中止反應(yīng),蘇術(shù)素復(fù)染,水性封片劑封片。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野,計(jì)算平均動(dòng)脈壁中膜TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占中膜細(xì)胞總數(shù)百分比,即頸動(dòng)脈中膜細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。1.5統(tǒng)計(jì)方法各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異用單因素方差分析和q檢驗(yàn),以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以P<0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1血壓mhgSHR組12周齡時(shí)的SBP明顯高于WKY組[(172.0±9.8)mmHgvs(123.4±5.1)mmHg,P<0.01],SHR各組間無(wú)顯著性差異。治療兩周后(14周齡)TelH組的SBP明顯下降,與SHR組有顯著性差異[(130.3±7.8)mmHgvs(170.5±8.0)mmHg,P<0.01],其降壓作用持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,但TelL組的SBP與SHR組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。如圖1所示。2.2mt、mcsa和mm2vs的比較見(jiàn)表130周齡SHR的頸動(dòng)脈中膜肥厚明顯,SHR組頸動(dòng)脈中膜厚度(MT)、中膜橫截面積(MCSA)較WKY組均明顯增高[(71.77±8.23)μmvs(43.97±5.28)μm,(0.136±0.017)mm2vs(0.098±0.011)mm2,P<0.01]。經(jīng)過(guò)18周替米沙坦治療后,血管中膜肥厚明顯減輕,TelH組的MT、MCSA較SHR組顯著下降[(44.19±4.18)μmvs(71.77±8.23)μm,(0.101±0.009)mm2vs(0.136±0.017)mm2,P<0.01],TelL組的MT較SHR組也明顯下降[(64.86±5.03)μmvs(71.77±8.23)μm,P<0.05],TelL組的MCSA較SHR組無(wú)明顯變化[(0.125±0.010)mm2vs(0.136±0.017)mm2,P>0.05];TelH組的MT、MCSA較TelL組顯著下降[(44.19±4.18)μmvs(64.86±5.03)μm,(0.101±0.009)mm2vs(0.125±0.010)mm2,P<0.01]。2.3shr頸動(dòng)脈重建中平滑肌細(xì)胞的變化2.3.1各組大鼠頸動(dòng)脈中膜細(xì)胞類型測(cè)定如圖2所示,各組頸動(dòng)脈切片行α-SMA免疫組化染色,結(jié)果:頸動(dòng)脈中膜呈陽(yáng)性反應(yīng),說(shuō)明頸動(dòng)脈中膜細(xì)胞類型為VSMCs。2.3.2兩組患者的表面電鏡見(jiàn)表1如圖3、圖4所示,各組頸動(dòng)脈中膜VSMCs平均核面積大小依次為:SHR組、TelL組、TelH組、WKY組,說(shuō)明SHR頸動(dòng)脈中膜VSMCs平均核面積明顯大于WKY,而TelH組的VSMCs平均核面積較SHR組的明顯減小[(34.36±4.73)μm2vs(53.27±6.05)μm2,P<0.01],TelL組較SHR組也減小[(47.92±5.78)μm2vs(53.27±6.05)μm2,P<0.05]。2.3.3頸動(dòng)脈中膜vsmcs的pi/ai的變化如圖5所示,血管壁的內(nèi)膜、中膜、外膜均有PCNA及TUNEL標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞,各組頸動(dòng)脈中膜PCNA染色陽(yáng)性的VSMCs數(shù)無(wú)明顯差別,而頸動(dòng)脈中膜TUNEL陽(yáng)性的VSMCs數(shù)SHR組較WKY組明顯減少,而TelH、TelL組較SHR組明顯增多。如圖6所示,各組頸動(dòng)脈中膜VSMCs的PI無(wú)顯著性差異(P>0.05)。頸動(dòng)脈中膜VSMCs的AI在各組中變化如圖7所示,其中SHR組明顯低于WKY組(P<0.01),而TelH、TelL組明顯高于SHR組(P<0.01)。頸動(dòng)脈中膜VSMCs的PI/AI在各組中變化如圖8所示,其中SHR組明顯高于WKY組(P<0.01),而TelH、TelL組明顯低于SHR組(P<0.01),尤其是TelH組較接近WKY組的水平。說(shuō)明30周齡的SHR頸動(dòng)脈VSMCs的增殖與WKY無(wú)明顯差異,但VSMCs的凋亡明顯減少,導(dǎo)致VSMCs的增殖/凋亡失衡,而替米沙坦治療增加VSMCs的凋亡,從而使其增殖/凋亡趨于平衡。2.4mcs平均核面積和ai的相關(guān)性分析頸動(dòng)脈中膜MCSA綜合反映了頸動(dòng)脈中膜的增生程度,故選它與頸動(dòng)脈中膜VSMCs平均核面積及AI進(jìn)行相關(guān)性分析。頸動(dòng)脈中膜VSMCs平均核面積與中膜MCSA呈正相關(guān)(r=0.536,P<0.01),頸動(dòng)脈中膜VSMCs的AI與中膜MCSA呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.872,P<0.01)(圖9)。3shr頸動(dòng)脈中膜制作質(zhì)量與增殖機(jī)制關(guān)系本研究結(jié)果顯示:30周齡的SHR頸動(dòng)脈中膜厚度(MT)、MCSA較WKY均有明顯增高(P<0.01),說(shuō)明SHR頸動(dòng)脈中膜發(fā)生了明顯肥厚的重構(gòu)。替米沙坦治療后TelH組的SBP明顯下降(P<0.01),其降壓作用持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,但TelL組的SBP與SHR組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。同時(shí)經(jīng)替米沙坦治療后TelH、TelL組的MT均明顯減小(P<0.05),TelH組的MCSA也明顯減小(P<0.01),說(shuō)明替米沙坦的治療不但能降低SHR的血壓,同時(shí)能改善SHR頸動(dòng)脈重構(gòu),特別是高劑量治療效果更為明顯。為了說(shuō)明SHR頸動(dòng)脈中膜肥厚重構(gòu)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制,本研究先應(yīng)用α-SMA標(biāo)記SHR和WKY的頸動(dòng)脈壁,結(jié)果各組中膜均呈陽(yáng)性反應(yīng),說(shuō)明SHR和WKY的中膜是由VSMCs組成。因此,SHR頸動(dòng)脈中膜肥厚的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制主要是VSMCs的變化引起。VSMCs總體積的增加可導(dǎo)致高血壓動(dòng)脈壁肥厚的重構(gòu),VSMCs總體積的增加可以是VSMCs體積的增大(肥大),也可以是VSMCs的數(shù)量增加(增殖或是凋亡減少)。VSMCs的肥大可表現(xiàn)為VSMCs的橫截面積增大,橫截面積大小有多種表示方法,本研究采用Levy等的方法以VSMCs的核面積來(lái)反映VSMCs的面積。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3、圖4)顯示,30周齡SHR組頸動(dòng)脈中膜VSMCs平均核面積顯著大于WKY組,提示SHR組VSMCs的面積明顯大于WKY組,進(jìn)一步分析顯示頸動(dòng)脈中膜VSMCs平均核面積與中膜MCSA呈正相關(guān)(圖9),以上均說(shuō)明VSMCs的肥大參與了SHR頸動(dòng)脈中膜肥厚重構(gòu)的發(fā)生與發(fā)展的過(guò)程。本研究采用PCNA標(biāo)記增殖的VSMCs,應(yīng)用頸動(dòng)脈中膜細(xì)胞PI反映VSMCs的增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5、圖6)顯示:30周齡的SHR頸動(dòng)脈血管壁VSMCs增殖細(xì)胞與WKY比較無(wú)明顯增多,而且各組的PI均無(wú)明顯差異,說(shuō)明VSMCs的增殖并非導(dǎo)致SHR頸動(dòng)脈中膜肥厚的主要細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制。凋亡是一種普遍存在的細(xì)胞的程序性死亡,凋亡是部分細(xì)胞更新的基本條件,VSMCs的凋亡在血管重構(gòu)中起著不可低估的作用。本研究采用TUNEL以反映頸動(dòng)脈中膜細(xì)胞凋亡并計(jì)算AI。結(jié)果(圖5、圖7)顯示,30周齡的SHR頸動(dòng)脈VSMCs凋亡數(shù)目明顯減少,SHR組的AI比WKY組減少90.71%(P<0.01),與Lemay等報(bào)道類似,提示SHR后期細(xì)胞凋亡的減少可能參與SHR頸動(dòng)脈的重構(gòu)。而頸動(dòng)脈中膜VSMCs的AI與中膜MCSA呈顯著負(fù)相關(guān)(圖9),提示VSMCs的凋亡在頸動(dòng)脈重構(gòu)中可能起重要作用。PI/AI是VSMCs增殖/凋亡指數(shù)的比值,正常情況下要處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)才能保持正常組織結(jié)構(gòu)和功能。黃文新等通過(guò)研究SHR主動(dòng)脈VSMCs凋亡的變化,結(jié)果認(rèn)為大動(dòng)脈的重構(gòu)是VSMCs增殖與凋亡失衡的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PI/AI比值SHR組比WKY組增高了11.85倍,說(shuō)明SHR的VSMCs增殖/凋亡明顯失衡,增殖/凋亡的失衡參與了SHR頸動(dòng)脈的重構(gòu)。本研究應(yīng)用替米沙坦的干預(yù),來(lái)進(jìn)一步闡明上述的VSMCs的凋亡減少、細(xì)胞肥大是SHR頸動(dòng)脈重構(gòu)的主要細(xì)胞學(xué)機(jī)制。結(jié)果提示替米沙坦治療后TelH組的頸動(dòng)脈中膜VSMCs平均核面積明顯降低45.78%(P<0.01),TelL組頸動(dòng)脈中膜的VSMCs平均核面積降低了10.04%(P<0.05),進(jìn)一步說(shuō)明SHR頸動(dòng)脈VSMCs的肥大是頸動(dòng)脈中膜肥厚重構(gòu)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制之一。替米沙坦治療后TelH、TelL組頸動(dòng)脈VSMCs的凋亡數(shù)目明顯增多,兩組的AI均較SHR組明顯增加,進(jìn)一步說(shuō)明VSMCs凋亡的減少是導(dǎo)致SHR頸動(dòng)脈中膜肥厚重構(gòu)的重要細(xì)胞學(xué)機(jī)制之一。經(jīng)替米沙坦治療后TelH、TelL組的PI/AI比值均明顯下降,尤其是大劑量的替米沙坦效果更為明顯,使PI/AI趨于接近WKY的平衡狀態(tài)。VSMCs增殖-凋亡的失衡參與了頸動(dòng)脈的重構(gòu),治療高血壓不僅要通過(guò)降壓改善血流動(dòng)力學(xué)及減輕血管結(jié)構(gòu)