血管平滑肌細胞在自發(fā)性高血壓大鼠頸動脈重構(gòu)中的作用及替米沙坦的干預(yù)效果

血管平滑肌細胞在自發(fā)性高血壓大鼠頸動脈重構(gòu)中的作用及替米沙坦的干預(yù)效果

國內(nèi)外科學(xué)家對sas血管重建（shr）的主要關(guān)注焦點是小型動脈炎、動脈炎、腎動脈炎和腸系膜動脈，但對頸部動脈重建的報道很少。近年隨著對高血壓發(fā)病機制的深入研究,證實頸動脈是高血壓的重要靶器官之一,其損害與預(yù)后密切相關(guān)。高血壓所致的頸動脈病變(重構(gòu))日益受到重視。血管平滑肌細胞(VSMCs)的改變是SHR血管重構(gòu)的主要內(nèi)容,對SHR頸動脈重構(gòu)中VSMCs變化包括VSMCs的增生(增殖或肥大)和凋亡等方面的研究報道很少。替米沙坦是血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體拮抗劑,其對SHR頸動脈重構(gòu)影響的研究尚未見報道。本文報道VSMCs的增殖、肥大及凋亡在SHR頸動脈重構(gòu)中的作用及替米沙坦的干預(yù)作用。1材料和方法1.1大鼠性別、周齡和年齡的測定30只12周齡雄性SHR大鼠,體重250~300g,隨機分為3組:高血壓組(SHR)、替米沙坦高劑量組(TelH)、替米沙坦低劑量組(TelL),另設(shè)同性別、周齡的10只WKY大鼠為對照組。大鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,合格證號:SCXK(滬2003-0003);12h光照/黑暗,飲用冷開水,自由攝食進水。1.2特效藥替米沙坦由德國勃林格殷格翰公司惠贈。1.3胞死亡檢測試驗鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(α-SMA,克隆號:1A4,即用型)、鼠抗人增殖細胞核抗原(PCNA,克隆號:PC10,即用型)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。原位細胞死亡檢測試劑盒(insitucelldeathdetectionkit,POD)購自Roche公司,0.25%胰蛋白酶、免疫組化試劑盒(SP-9000)、顯色劑(AEC和DAB)購自北京中山生物技術(shù)有限公司。大鼠血壓心率測定儀(RBP-1B型,北京中日友好醫(yī)院臨床研究所),顯微鏡(OlympusBX41,日本),計算機輔助圖像分析系統(tǒng)(Image-ProPlus,Version:4.5,MediaCybernetics,Inc,USA),電子天平(FA2004型,上海天平儀器廠)。1.4方法1.4.1替米沙坦胃被調(diào)劑al每日8:00替米沙坦高劑量組(TelH)、替米沙坦低劑量組(TelL)分別給予替米沙坦8mg/(kg·d)-1、0.8mg/(kg·d)-1溶于2ml蒸餾水中灌胃,SHR組及WKY組予2ml蒸餾水灌胃。18周后結(jié)束實驗。1.4.2頸動脈中膜形態(tài)變化的檢測(1)大鼠無創(chuàng)血壓測定大鼠于40℃預(yù)熱15min,用大鼠RBP-1B型大鼠血壓儀測量大鼠清醒安靜狀態(tài)下尾動脈的收縮壓(SBP)。實驗開始及之后每兩周測一次血壓。(2)標(biāo)本收集及組織化學(xué)染色實驗結(jié)束時予以氯胺酮/地西泮混合(75/5mg/kg)腹腔注射麻醉,于頸總動脈分叉上0.5cm處剪下左側(cè)頸總動脈,予以PBS液沖洗管腔后立即置入10%PBS甲醛固定,取頸總動脈分叉處下方0.5cm以下部分,頸總動脈分叉下0.5cm處朝上,進行垂直石蠟包埋,連續(xù)切片,制成4μm切片。每組每條血管的切片依序取第4~6張行彈力纖維和膠原纖維的雙重染色法(P/VB法)染色。第7~9張,行HE染色。(3)各組大鼠頸動脈中膜增生程度測定在彈力纖維和膠原纖維的雙重染色法(P/VB法)染色的切片,可見內(nèi)、外彈力膜間是血管中膜,在計算機輔助圖像分析系統(tǒng)下,隨機取10處分別測頸動脈中膜厚度,取平均值,同一條血管的3張切片再次取平均值,即為頸動脈中膜厚度(MT);測頸動脈外彈力膜圈內(nèi)面積及內(nèi)彈力膜圈內(nèi)面積,中膜橫截面積=外彈力膜圈內(nèi)面積-內(nèi)彈力膜圈內(nèi)面積,同一條血管的3張切片取平均值,即為頸動脈中膜橫截面積(MCSA)。(4)中膜細胞平均核面積測定用計算機輔助圖像分析系統(tǒng),在HE染色下每張切片隨機取10個高倍視野,分別測量中膜細胞核面積,并分別取平均值,即為中膜細胞平均核面積。(5)S-P免疫組化染色每組每條血管的切片依序取第10~12張行α-SMA免疫組化染色,第13~15張行PCNA免疫組化染色。嚴格按說明書操作,簡述如下:切片常規(guī)脫蠟至水化,3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性,α-SMA、PCNA均用微波修復(fù),分別滴加抗體α-SMA、PCNA,置濕盒4℃溫育過夜,通用型生物素標(biāo)記鼠二抗37℃溫育30min,以上各步驟間用PBS沖洗2min共3次。α-SMA用AEC顯色,陽性信號呈紅色;PCNA用DAB顯色,陽性信號呈棕黑色。鏡下控制反應(yīng)時間,蒸餾水中止反應(yīng),蘇術(shù)素復(fù)染。DAB顯色切片經(jīng)酒精脫水,二甲笨透明,中性樹膠封片;AEC顯色切片用水性封片劑封片。PCNA免疫組化染色每張切片隨機選擇10個高倍視野,計數(shù)平均動脈中膜PCNA陽性細胞數(shù)占中膜細胞總數(shù)百分比,即頸動脈中膜細胞增殖指數(shù)(PI)。(6)原位末端標(biāo)記(TUNEL)法標(biāo)記凋亡細胞每組每條血管的切片依序取第16~18張,嚴格按說明書操作,簡述如下:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化,用0.25%胰蛋白酶37℃溫育30min,滴加50μl的TUNEL反應(yīng)混合液,在濕盒中37℃溫育60min,滴加50μl轉(zhuǎn)化劑-POD,在濕盒中37℃溫育30min;以上各步驟間用PBS沖洗2min共3次。用AEC顯色,陽性細胞核呈紅色。鏡下控制反應(yīng)時間,蒸餾水中止反應(yīng),蘇術(shù)素復(fù)染,水性封片劑封片。每張切片隨機選擇10個視野,計算平均動脈壁中膜TUNEL陽性細胞數(shù)占中膜細胞總數(shù)百分比,即頸動脈中膜細胞凋亡指數(shù)(AI)。1.5統(tǒng)計方法各組實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異用單因素方差分析和q檢驗,以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義,以P<0.01為有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1血壓mhgSHR組12周齡時的SBP明顯高于WKY組[(172.0±9.8)mmHgvs(123.4±5.1)mmHg,P<0.01],SHR各組間無顯著性差異。治療兩周后(14周齡)TelH組的SBP明顯下降,與SHR組有顯著性差異[(130.3±7.8)mmHgvs(170.5±8.0)mmHg,P<0.01],其降壓作用持續(xù)至實驗結(jié)束,但TelL組的SBP與SHR組均無顯著性差異(P>0.05)。如圖1所示。2.2mt、mcsa和mm2vs的比較見表130周齡SHR的頸動脈中膜肥厚明顯,SHR組頸動脈中膜厚度(MT)、中膜橫截面積(MCSA)較WKY組均明顯增高[(71.77±8.23)μmvs(43.97±5.28)μm,(0.136±0.017)mm2vs(0.098±0.011)mm2,P<0.01]。經(jīng)過18周替米沙坦治療后,血管中膜肥厚明顯減輕,TelH組的MT、MCSA較SHR組顯著下降[(44.19±4.18)μmvs(71.77±8.23)μm,(0.101±0.009)mm2vs(0.136±0.017)mm2,P<0.01],TelL組的MT較SHR組也明顯下降[(64.86±5.03)μmvs(71.77±8.23)μm,P<0.05],TelL組的MCSA較SHR組無明顯變化[(0.125±0.010)mm2vs(0.136±0.017)mm2,P>0.05];TelH組的MT、MCSA較TelL組顯著下降[(44.19±4.18)μmvs(64.86±5.03)μm,(0.101±0.009)mm2vs(0.125±0.010)mm2,P<0.01]。2.3shr頸動脈重建中平滑肌細胞的變化2.3.1各組大鼠頸動脈中膜細胞類型測定如圖2所示,各組頸動脈切片行α-SMA免疫組化染色,結(jié)果:頸動脈中膜呈陽性反應(yīng),說明頸動脈中膜細胞類型為VSMCs。2.3.2兩組患者的表面電鏡見表1如圖3、圖4所示,各組頸動脈中膜VSMCs平均核面積大小依次為:SHR組、TelL組、TelH組、WKY組,說明SHR頸動脈中膜VSMCs平均核面積明顯大于WKY,而TelH組的VSMCs平均核面積較SHR組的明顯減小[(34.36±4.73)μm2vs(53.27±6.05)μm2,P<0.01],TelL組較SHR組也減小[(47.92±5.78)μm2vs(53.27±6.05)μm2,P<0.05]。2.3.3頸動脈中膜vsmcs的pi/ai的變化如圖5所示,血管壁的內(nèi)膜、中膜、外膜均有PCNA及TUNEL標(biāo)記陽性細胞,各組頸動脈中膜PCNA染色陽性的VSMCs數(shù)無明顯差別,而頸動脈中膜TUNEL陽性的VSMCs數(shù)SHR組較WKY組明顯減少,而TelH、TelL組較SHR組明顯增多。如圖6所示,各組頸動脈中膜VSMCs的PI無顯著性差異(P>0.05)。頸動脈中膜VSMCs的AI在各組中變化如圖7所示,其中SHR組明顯低于WKY組(P<0.01),而TelH、TelL組明顯高于SHR組(P<0.01)。頸動脈中膜VSMCs的PI/AI在各組中變化如圖8所示,其中SHR組明顯高于WKY組(P<0.01),而TelH、TelL組明顯低于SHR組(P<0.01),尤其是TelH組較接近WKY組的水平。說明30周齡的SHR頸動脈VSMCs的增殖與WKY無明顯差異,但VSMCs的凋亡明顯減少,導(dǎo)致VSMCs的增殖/凋亡失衡,而替米沙坦治療增加VSMCs的凋亡,從而使其增殖/凋亡趨于平衡。2.4mcs平均核面積和ai的相關(guān)性分析頸動脈中膜MCSA綜合反映了頸動脈中膜的增生程度,故選它與頸動脈中膜VSMCs平均核面積及AI進行相關(guān)性分析。頸動脈中膜VSMCs平均核面積與中膜MCSA呈正相關(guān)(r=0.536,P<0.01),頸動脈中膜VSMCs的AI與中膜MCSA呈顯著負相關(guān)(r=-0.872,P<0.01)(圖9)。3shr頸動脈中膜制作質(zhì)量與增殖機制關(guān)系本研究結(jié)果顯示:30周齡的SHR頸動脈中膜厚度(MT)、MCSA較WKY均有明顯增高(P<0.01),說明SHR頸動脈中膜發(fā)生了明顯肥厚的重構(gòu)。替米沙坦治療后TelH組的SBP明顯下降(P<0.01),其降壓作用持續(xù)至實驗結(jié)束,但TelL組的SBP與SHR組均無顯著性差異(P>0.05)。同時經(jīng)替米沙坦治療后TelH、TelL組的MT均明顯減小(P<0.05),TelH組的MCSA也明顯減小(P<0.01),說明替米沙坦的治療不但能降低SHR的血壓,同時能改善SHR頸動脈重構(gòu),特別是高劑量治療效果更為明顯。為了說明SHR頸動脈中膜肥厚重構(gòu)的細胞學(xué)機制,本研究先應(yīng)用α-SMA標(biāo)記SHR和WKY的頸動脈壁,結(jié)果各組中膜均呈陽性反應(yīng),說明SHR和WKY的中膜是由VSMCs組成。因此,SHR頸動脈中膜肥厚的細胞生物學(xué)機制主要是VSMCs的變化引起。VSMCs總體積的增加可導(dǎo)致高血壓動脈壁肥厚的重構(gòu),VSMCs總體積的增加可以是VSMCs體積的增大(肥大),也可以是VSMCs的數(shù)量增加(增殖或是凋亡減少)。VSMCs的肥大可表現(xiàn)為VSMCs的橫截面積增大,橫截面積大小有多種表示方法,本研究采用Levy等的方法以VSMCs的核面積來反映VSMCs的面積。本實驗結(jié)果(圖3、圖4)顯示,30周齡SHR組頸動脈中膜VSMCs平均核面積顯著大于WKY組,提示SHR組VSMCs的面積明顯大于WKY組,進一步分析顯示頸動脈中膜VSMCs平均核面積與中膜MCSA呈正相關(guān)(圖9),以上均說明VSMCs的肥大參與了SHR頸動脈中膜肥厚重構(gòu)的發(fā)生與發(fā)展的過程。本研究采用PCNA標(biāo)記增殖的VSMCs,應(yīng)用頸動脈中膜細胞PI反映VSMCs的增殖。實驗結(jié)果(圖5、圖6)顯示:30周齡的SHR頸動脈血管壁VSMCs增殖細胞與WKY比較無明顯增多,而且各組的PI均無明顯差異,說明VSMCs的增殖并非導(dǎo)致SHR頸動脈中膜肥厚的主要細胞生物學(xué)機制。凋亡是一種普遍存在的細胞的程序性死亡,凋亡是部分細胞更新的基本條件,VSMCs的凋亡在血管重構(gòu)中起著不可低估的作用。本研究采用TUNEL以反映頸動脈中膜細胞凋亡并計算AI。結(jié)果(圖5、圖7)顯示,30周齡的SHR頸動脈VSMCs凋亡數(shù)目明顯減少,SHR組的AI比WKY組減少90.71%(P<0.01),與Lemay等報道類似,提示SHR后期細胞凋亡的減少可能參與SHR頸動脈的重構(gòu)。而頸動脈中膜VSMCs的AI與中膜MCSA呈顯著負相關(guān)(圖9),提示VSMCs的凋亡在頸動脈重構(gòu)中可能起重要作用。PI/AI是VSMCs增殖/凋亡指數(shù)的比值,正常情況下要處于動態(tài)平衡狀態(tài)才能保持正常組織結(jié)構(gòu)和功能。黃文新等通過研究SHR主動脈VSMCs凋亡的變化,結(jié)果認為大動脈的重構(gòu)是VSMCs增殖與凋亡失衡的結(jié)果。本實驗結(jié)果顯示,PI/AI比值SHR組比WKY組增高了11.85倍,說明SHR的VSMCs增殖/凋亡明顯失衡,增殖/凋亡的失衡參與了SHR頸動脈的重構(gòu)。本研究應(yīng)用替米沙坦的干預(yù),來進一步闡明上述的VSMCs的凋亡減少、細胞肥大是SHR頸動脈重構(gòu)的主要細胞學(xué)機制。結(jié)果提示替米沙坦治療后TelH組的頸動脈中膜VSMCs平均核面積明顯降低45.78%(P<0.01),TelL組頸動脈中膜的VSMCs平均核面積降低了10.04%(P<0.05),進一步說明SHR頸動脈VSMCs的肥大是頸動脈中膜肥厚重構(gòu)的細胞學(xué)機制之一。替米沙坦治療后TelH、TelL組頸動脈VSMCs的凋亡數(shù)目明顯增多,兩組的AI均較SHR組明顯增加,進一步說明VSMCs凋亡的減少是導(dǎo)致SHR頸動脈中膜肥厚重構(gòu)的重要細胞學(xué)機制之一。經(jīng)替米沙坦治療后TelH、TelL組的PI/AI比值均明顯下降,尤其是大劑量的替米沙坦效果更為明顯,使PI/AI趨于接近WKY的平衡狀態(tài)。VSMCs增殖-凋亡的失衡參與了頸動脈的重構(gòu),治療高血壓不僅要通過降壓改善血流動力學(xué)及減輕血管結(jié)構(gòu)