循環(huán)腫瘤細胞的富集與檢測

循環(huán)腫瘤細胞的富集與檢測

腫瘤是我國最常見的腫瘤之一。超過90%腫瘤患者的死亡是由腫瘤轉移引起的。轉移瘤是腫瘤最顯著的特征之一。腫瘤細胞因病理和化學治療而從原腫瘤中排出，并因表皮-質子轉化（pmt）而發(fā)生變化。作為一個流動特征，它進入毛細管和周期化。ctc是腫瘤轉移過程中血液循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細胞。這是腫瘤轉移的必要條件。ctc的檢測有助于研究腫瘤轉移機制、領導腫瘤治療、評估治療效果以及為評估預后提供可靠建議。這是國內(nèi)外腫瘤治療的焦點。然而，ctc在血液中濃度很低，出現(xiàn)概率約為1ctc/109。因此，ctc研究的關鍵是能夠在復雜環(huán)境中高效、快速、正確地積累和檢測ctc。納米科技是指在納米尺度(從單個原子、分子到亞微米尺度之間)上研究物質的特性和相互作用,以及由納米結構集成的功能系統(tǒng).隨著納米科學與技術的發(fā)展,人們獲得了結構可控的、表面功能化的納米材料和納米結構,同時在微流控技術及納米器件方面實現(xiàn)了對微量液體的精確操縱以及微弱信號的精確測量,從而在減少血樣量的同時,大大提高了CTC的富集率和檢測靈敏度.靶向CTC表面標志物的特異性識別分子修飾的納米材料結合微流控技術的CTC檢測平臺研究受到了科學家的廣泛關注,并取得了令人矚目的成果.2013年,《自然》(Nature)雜志將CTC納米檢測列為最具創(chuàng)新性和轉化潛力的腫瘤診斷新方法.新納米材料、納米器件以及納米表征測量技術的應用對CTC檢測技術的進步已經(jīng)并即將產(chǎn)生巨大的影響,下面就納米材料、納米結構表面、微流控技術、納米檢測技術等幾個方面,對CTC富集和檢測納米技術的最新進展進行簡要介紹.1ctc的富集和檢測大多數(shù)實體瘤都是上皮來源的,因而CTC細胞表面的上皮細胞黏附分子(EpCAM)是最為常用的CTC表面抗原,廣泛用于各種納米材料、納米結構的表面修飾以實現(xiàn)CTC的富集.隨著納米技術的發(fā)展,人們可獲得結構可控、表面功能化的不同種納米材料,納米材料所表現(xiàn)出的小尺寸效應、高比表面積等諸多不同于一般材料的特性,使血液中極少量的CTC的捕獲成為可能.納米材料與納米結構與CTC的高接觸幾率,也可以大大提高CTC的富集效率,被廣泛用于CTC的富集和檢測.1.1ctc的富集和釋放目前,富集技術主要包括免疫磁珠富集、基于血液中各種細胞特征密度的密度梯度離心法、基于細胞尺寸的膜過濾法、雙向電泳等,其中免疫磁珠技術由于方法簡單、快捷、富集效率較高,是臨床的首選方法.然而,由于技術的限制,早期的磁珠只能達到微米級,與納米磁珠相比,微米磁珠因其比表面積低、尺寸大、穩(wěn)定性差、易聚沉等原因,導致細胞分離效率低,并且分離出的細胞很難將磁珠洗脫而保持細胞活性,使得進一步的分析也很困難.近年來,納米技術的發(fā)展使磁珠大小達到了納米級(10~100nm),增大的比表面積增加了與待測細胞的接觸幾率,更好地分散性降低了對細胞造成的機械性壓力,大大提高了CTC的富集率.Xu等制備了EpCAM抗體修飾的聚合物包被的鐵磁性納米顆粒(30nm),并對1ml血液里的極少量乳腺癌細胞進行了富集,其最大捕獲效率高達84%.為了提高磁性材料的富集率,人們探索不同組成的磁性材料(如納米鐵、碳包被的納米鐵)的富集效率,并同時試圖增強磁性響應速度和分散性,以提高CTC的捕獲速率和被捕獲細胞的活性.目前,用于臨床的CellSearch是唯一通過美國FDA和我國SFDA批準的CTC檢測設備,該檢測平臺就是基于納米免疫磁珠的CTC富集技術,能夠對7.5ml血液樣品進行分析檢測,具有良好的再現(xiàn)性,已被用于轉移性乳腺癌、肺癌、結直腸癌和前列腺癌的臨床CTC檢測,用來預測無進展生存期和總生存期.1.2非磁性材料的ctc富藏1.2.1納米導電聚合物納米表面的制備和釋放方法盡管免疫磁珠富集技術在臨床上得到了廣泛應用,但是該技術中捕獲了CTC的納米磁珠在磁場富集過程中易發(fā)生聚集,在這樣的機械壓力下,細胞形態(tài)及活性會受到影響.另一方面,被捕獲的CTC表面結合了磁珠,不利于CTC的進一步分析檢測.因此,一些非磁性納米材料在CTC富集中的應用受到了研究者們的廣泛關注.將抗體功能化的不同形狀的納米材料(納米顆粒、納米線等)固定在基底上用于CTC富集,既提高了細胞與捕獲靶點的接觸幾率,又方便將CTC細胞從表面洗脫,減少納米顆粒吸附對于細胞活力和分析檢測的影響,從而提高了細胞的富集率和檢測準確性,并且可以實現(xiàn)CTC富集檢測的一體化.我國科學家王樹濤等與日本科學家Yu合作,恒壓條件下,通過電化學方法在氧化銦錫包被的玻璃表面成功制得大小尺寸分布均一的聚3,4-亞乙二氧基噻吩導電聚合物納米點,然后對納米點表面修飾EpCAM抗體,從而對CTC進行富集(圖1).與光滑的導電聚合物薄膜相比,這種具有低寬高比的納米點薄膜增加了捕獲靶點,富集率提高了4~5倍.該納米導電聚合物具有合成方法簡單、易功能化、與細胞機械性能相匹配等優(yōu)點,在CTC檢測中有良好的應用前景.武漢大學Zhang等利用功能化二氧化鈦納米電紡絲包被基底,實現(xiàn)血液中CTC的分離富集(圖2).除了功能化識別抗體,基底沉積的電紡絲水平排列,其拓撲結構與細胞外基質的相互作用在提高CTC捕獲率方面也起到了很大的作用.研究表明:細胞表面的納米結構組件(微絨毛和絲狀偽足)與細胞外基質相互作用,將影響細胞的黏附、活性、遷移及分化等功能.因而通過納米技術模仿細胞外基質結構構建一些納米表面,調控細胞黏附性,可以實現(xiàn)對CTC的捕獲.二氧化鈦納米電紡絲在基底上的鋪設方向和密度容易控制,對基底沒有特殊要求,使此CTC捕獲平臺的構建成為可能.無論是磁性的或是非磁性的納米免疫富集方法,均是利用納米材料的大比表面,增大待測細胞與靶點的接觸幾率,納米材料的這一特點恰好解決了血液中CTC檢測量極少的問題.1.2.2納米結構的作用免疫分離方法主要基于細胞表面特異性表達的蛋白,然而,這些蛋白的表達在腫瘤細胞轉移過程中會發(fā)生變化,從而造成CTC檢測結果假陰性.研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞和正常細胞在粗糙表面上具有不同的黏附特性,因此科學家們開始探索利用納米粗糙表面(如功能化的納米線、納米柱)分離血液中的CTC.Chen等用離子刻蝕的方法得到不同粗糙度(1、50、100、150nm)的玻璃表面,進一步實驗結果表明,隨著粗糙度的增加,腫瘤細胞在其表面的黏附增多,而正常細胞則不受影響(圖3).通過血細胞與腫瘤細胞在納米粗糙表面的不同黏附特性實現(xiàn)CTC的分離富集.Wan等為了提高納米材料對腫瘤細胞的黏附,又在基底表面上修飾了多水高嶺石納米管和E-選擇素分子(E-selectin)功能化的阿霉素脂質體,從而大大提高了CTC的選擇性.也有課題組將聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成有納米紋理結構的表面,一改常用的光滑PDMS表面,從細胞物理結構性能的角度出發(fā)實現(xiàn)了CTC富集效率的提高.這種基于納米結構物理性能的CTC富集技術不依賴于抗原-抗體相互作用,雖然富集效率有所降低,但是避免了因細胞表面特異性抗原丟失所導致的假陰性結果.如果將基于納米結構的高效富集表面與免疫分離技術相結合,必將大大提高CTC的富集效率.美國耶魯大學癌癥研究中心的Lee等利用掩膜刻蝕技術,在透明石英基底上構建了石英納米線陣列,并在表面進行了EpCAM抗體功能化,這種納米拓撲結構平臺能夠高效、快速地富集非小細胞肺癌A549細胞.美國加州大學洛杉磯分校的Wang等和Hou等在硅納米陣列上修飾抗體功能化的熱響應性聚合物N-異丙基丙烯酰胺,從而實現(xiàn)捕獲的CTC細胞的溫度可控釋放(圖4).1.3微流控芯片隨著半導體微加工技術的發(fā)展,微流控芯片已經(jīng)受到科學家們的廣泛關注.微流控技術是一種針對極小量(10-9~10-18L)流體進行操控的系統(tǒng)科學技術.微流控芯片是微流控技術實現(xiàn)的主要平臺和技術裝置,其主要特征是容納流體的有效結構(通道、反應室和其他某些功能部件)至少在一個維度上為微米級尺度.對腫瘤病人血液中極少量的CTC檢測時,樣本量有限的問題成為CTC檢測的一個重要瓶頸.然而基于納米材料構建微流控芯片或將納米材料與微流控通道相結合的技術能夠很好地克服這一難題.Stott等最先將微流控芯片用于CTC的檢測,如圖5所示,他們構建了一種腫瘤細胞表面特異性識別抗體功能化的魚骨形(HB)芯片,血液流過一個可視通道,通道內(nèi)魚骨形溝回能夠引起血液的一個輕微斡旋,從而增強了其與抗體修飾表面的接觸.與FDA批準目前用于臨床的CellSearch檢測相比,該技術不用對血液樣品進行預處理,具有更好的靈敏度.值得一提的是,這種方法獲得的CTC仍能夠保持活性,用于進一步的分析.為了進一步提高微流控芯片的CTC捕獲率和靈敏性,研究者們對納米材料與微流控技術相結合用于CTC的富集做了很多研究,例如下面談到的利用納米材料與微流控技術結合進行CTC富集的工作.1.3.1玻璃表面ctc的富集和強化基于磁性免疫富集技術的CellSearch的成功證明了磁珠捕獲方法的優(yōu)勢.但是,該系統(tǒng)也還存在檢測成本高、樣品用量多、樣品檢測時間長、檢測過程封閉等諸多不足.微流控芯片的樣品量小、流速可控及構件透明性等特點,為進一步改進CellSearch的CTC檢測技術提供了技術支持.Hoshino課題組將基于PDMS的微流通道固定于玻璃表面,在玻璃一側放有磁鐵,對CTC進行富集.透明玻璃可以實現(xiàn)CTC檢測過程的可視化;免疫磁性納米顆粒捕獲的CTC會在一個梯度場強的作用下,分散在一定面積的玻璃表面,避免了聚集;對于分散在玻璃表面的CTC還可以直接進行進一步分析.實驗結果表明,與CellSearch相比,微流通道內(nèi)的磁場梯度使得即使在一個較高的流速下,仍能達到較高的捕獲率.在此系統(tǒng)中,磁珠用量也減少25%.1.3.2nanoelcro檢測芯片Toner課題組在微流控芯片用于CTC富集方面的工作,給納米科學家一個很好的提示,將納米材料與微流控芯片相結合,可以進一步提高細胞與捕獲靶點的接觸,從而在解決臨床檢測中血樣量多的同時,解決單一使用微流控芯片時富集靈敏度較低等問題.Hou等構建CTC表面特異性識別抗體包被的硅納米柱陣列和能使血液樣品混合的在微流通道相組合的CTCNanovelcro檢測芯片,通過控制微流通道長度,流體流速等因素提高了CTC的捕獲靈敏度.為了近一步提高捕獲效率并實現(xiàn)捕獲CTC的可控釋放,我國科學家方曉紅,侯爽,熊斌等與Hou等合作開發(fā)了第二代Nanovelcro芯片,用納米線替代原有的硅納米柱,改變拓撲結構,增加了細胞表面識別探針與細胞的接觸;用核酸適配體(aptamer)探針替代抗體對CTC進行捕獲,核酸適配體在酶的作用下可輕松與靶細胞解離,從而實現(xiàn)捕獲CTC的可控釋放.隨后,Hou等又開發(fā)了有機聚合物納米線包埋的PN-Nanovelcro透明基底,替代以前的硅基底,從而使CTC捕獲過程可視化,并且該基底可以實現(xiàn)單細胞的顯微切割,為進一步的單細胞基因組學分析打下了基礎.Hou等還創(chuàng)辦了名為CytoLuminaTechnologies的公司以實現(xiàn)以上研究工作的商業(yè)化.這一系列結合了納米結構和微流控技術的CTC檢測裝置(圖6)無不說明納米技術在CTC富集中的重要作用,這部分工作也被2013年的《自然》(Nature)雜志作為亮點工作進行報道.結合了納米技術的微流控技術為CTC捕獲打開了新的大門.2納米材料結構的特點對富集出的極少量CTC進一步分析鑒定是CTC檢測中的另一個重要環(huán)節(jié),目前的方法主要有免疫學檢測、實時定量PCR檢測、酶聯(lián)免疫斑點印跡等方法.由于富集到的CTC數(shù)量極少并有可能已經(jīng)失去活性,這些普通的生物學檢測方法很難對其進行及時準確的計數(shù)和分析.然而,所有的納米材料都具有三個共同的結構特點:a.納米尺度的結構單元或特征維度尺寸在納米數(shù)量級(1~100nm);b.有大量的界面或自由表面;c.各納米單元之間存在著或強或弱的相互作用.由于這種結構上的特殊性,納米材料具有一些獨特的效應包括小尺寸效應、量子尺寸效應、界面效應以及宏觀量子遂道效應,使納米材料在性能上與具有相同組成的傳統(tǒng)概念上的微米材料有非常顯著的差異表現(xiàn)出許多優(yōu)異的性能和全新的功能,這些特殊的光學、電學、聲學性質為CTC檢測提供了新的途徑.2.1金屬哌納米顆粒的光生物傳感檢測量子點又名半導體納米微晶粒,是一種直徑在1~100nm之間,能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導體納米顆粒.其諸多特性,如發(fā)光光譜依賴尺寸變化的可控性、光穩(wěn)定性、寬激發(fā)譜窄發(fā)射譜、熒光壽命長、生物相容性好等,使其克服了現(xiàn)有普通有機熒光染料在生物樣品熒光成像中的不足.目前,有課題組基于量子點獨特的發(fā)光性能,將其用于納米磁珠CTC富集的輔助檢測.Zhang等合成了粒徑分布為2.8~7.3nm兩種不同發(fā)光波長的CdTe量子點,并在其表面偶聯(lián)肺癌細胞特異性識別抗體,對免疫磁珠富集后的肺癌細胞進行了雙色鑒定.Efstathopoulos則將ZnS和聚合物修飾的15~20nm尺寸范圍的CdSe量子點直接偶聯(lián)在免疫磁性納米磁珠上,從而實現(xiàn)了CTC富集、鑒定的一體化,提高了CTC檢測速度和效率.與量子點相比,金屬鉍納米顆粒靈敏、特異、簡單的X射線熒光光譜在生物標志物檢測中有著良好的應用前景.Hossain等用腫瘤特異性識別抗體修飾70~95nm鉍納米顆粒,對免疫磁性富集的CTC進行了檢測.一維納米材料有巨大的比表面積、很高的表面活性,其對周圍環(huán)境敏感響應使其在光生物傳感方面有著良好的應用前景,納米線在光生物傳感器中有著良好的應用前景.Sioss等制備出納米線陣列光生物傳感器件,并將50nm金納米顆粒修飾于納米線表面通過增加質量來提高傳感器的響應靈敏性.反射干擾檢測(RIfS)是一種在薄膜表面或納米拓撲結構表面上,發(fā)生入射光和反射光相互干擾的光譜檢測方法.澳大利亞科學家Kumeria等用電化學方法制備的多孔陽極氧化鋁(AAO)用于CTC無標記反射干擾光譜測量.在陽極氧化鋁膜上下產(chǎn)生的光反射導致產(chǎn)生Fabry-Perot特征干涉條紋,而結合了細胞的多孔膜結構折射率和膜厚度引起Fabry-Perot特征干涉條紋信號偏移.這種高有序三維納米孔結構材料的機械、化學和熱穩(wěn)定性及易功能化等特點使其在反射干擾檢測中有很強的檢測信號(圖7).2.2金納米顆粒與ctc的光聲檢測技術在體的熒光檢測技術,一方面受到體內(nèi)組織光猝滅、光漂白、強的光散射和背景自發(fā)熒光等因素的限制,另一方面,該技術血樣需求量大,耗時長,因而開發(fā)一種無熒光物標記的快速準確體內(nèi)成像檢測技術十分必要.光聲成像是近年來發(fā)展起來的一種無損醫(yī)學成像方法,它結合了純光學成像的高對比度特性和純超聲成像的高穿透深度特性,可以提供高分辨率和高對比度的組織成像.該技術工作原理:當納秒量級的脈沖激光照射生物組織時,組織內(nèi)的吸收體吸收激光能量,局部的溫度發(fā)生瞬時改變,導致體積膨脹,產(chǎn)生光聲信號.納米顆粒的強光吸收和光穩(wěn)定性使其常被用來作為體內(nèi)光聲成像的對比劑.金納米顆?？梢杂行г鰪娊M織內(nèi)的特異性吸收,并通過控制納米顆粒尺寸得到所需的光吸收波長.研究結果表明,與傳統(tǒng)的光吸收對比劑相比,納米金對光的吸收要強105倍左右,極大地增強了組織的光學吸收,從而有效地改善了光聲圖像質量.目前金納米顆粒已被應用于CTC的體內(nèi)光聲檢測.為了克服光聲檢測技術對快速流動的CTC捕獲信號響應慢的問題,Galanzha等和Kim等利用具有強磁性的磁性納米顆粒和具有光強吸收性的金包覆碳納米管兩種納米材料,金包覆碳納米管在639、900nm處強的光吸收會給出10μs的時間延遲檢測信號,從而實現(xiàn)體內(nèi)CTC的實時快速多色光聲檢測.基于這兩種納米材料的CTC檢測平臺將磁性富集技術和靈敏性、特異性強的光聲診斷技術有效結合,與體外檢測技術相比,該技術能夠從大量血液中檢測CTC,故其檢測靈敏度最大能提高103倍(圖8).2.3金納米粒子電化學檢測caco2腫瘤細胞的研究進展基于顯像的單細胞分析非常耗時,并且熒光標記和檢測儀的高昂價格導致測試成本較高.另外,熒光染料標記的細胞會影響細胞的分子組學檢測,并且由于自身熒光的問題,該系統(tǒng)在靈敏度、特異性方面也有待提高.相比較而言,基于金納米粒子在析氫反應中電催化性能的電化學檢測就能夠克服這些缺點.西班牙科學家Maltez-daCosta等發(fā)展了一種20nm金納米粒子電化學檢測Caco2腫瘤細胞的方法.這種方法的原理是通過抗體功能化的磁性納米材料對樣品中的CTC進行富集,而后根據(jù)結合的納米金顆粒數(shù)目不同所導致的電催化析氫反應中電流的不同來間接反映捕獲的CTC數(shù)量.實驗結果顯示,在最優(yōu)的測量條件下,測得的電流值與細胞數(shù)在1×103~3.5×104范圍內(nèi)成線性相關.金納米粒子具有的還原性能、強的電催化活性、特殊的光及電化學活性,使其適合作為腫瘤細胞的標記探針.與傳統(tǒng)的基于酶和染料標記的分析方法相比,在免疫分析中使