心腦脈絡(luò)復(fù)元湯對異丙腎上腺素致大鼠心肌損傷的保護作用

心腦脈絡(luò)復(fù)元湯對異丙腎上腺素致大鼠心肌損傷的保護作用

大劑量異丙醇可復(fù)制心血管動物模型，導致類似于缺血性心肌損傷的病理改變。心腦脈絡(luò)復(fù)元湯具有行氣活血、化痰通絡(luò)、扶正寧心的作用,筆者臨床實踐證明對防治冠心病有良好的療效。本研究用異丙腎上腺素復(fù)制心肌損傷大鼠模型,采用心腦脈絡(luò)復(fù)元湯進行干預(yù),觀察其對模型病理改變的影響和對心肌細胞凋亡的作用。1材料和方法1.1動物健康雄性Wistar大鼠40只,體重(300±20)g(由湖北省實驗動物研究中心提供)。1.2心腦脈絡(luò)復(fù)元湯、顆粒質(zhì)量分數(shù)粉鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn),批號:120303)。復(fù)方丹參片(0.6g/片,北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn),批號:1123572),實驗前研末以生理鹽水配制成0.1g/mL濃度懸液。心腦脈絡(luò)復(fù)元湯(主要由黃芪、麥冬、黃精、瓜蔞皮、薤白、丹參、川芎、郁金等組成,武漢市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供,水煎煮沸,再續(xù)煎30min,取汁2次,濃縮至含生藥量1.5g/mL藥液)。細胞凋亡檢測試劑盒、Bax和Bcl-2免疫組化染色試劑盒(購自武漢市博士德生物工程有限公司)。1.3大鼠單次注射sdd大鼠先作ECG檢查,棄去ST-T有異常改變者和心律失常者,完全隨機分為4組,每組10只,分別為生理鹽水對照組,異丙腎上腺素缺血組(模型對照組),復(fù)方丹參片對照組和心腦脈絡(luò)復(fù)元湯干預(yù)組。動物飼養(yǎng)3d,以適應(yīng)環(huán)境及消除麻醉藥物對大鼠的影響。第4天開始灌胃給藥,前兩組灌服生理鹽水,后兩組給予相應(yīng)的藥液8mL/kg,每天1次,連續(xù)灌服9d。末次灌胃2h后,給生理鹽水對照組大鼠皮下多點注射生理鹽水80mL/kg,給其余3組大鼠皮下多點注射異丙腎上腺素40mg/kg。記錄注射前和注射后20min時的ECG,觀察ST-T等改變情況。注射異丙腎上腺素20min后,可見室性早搏,ST段明顯抬高。注射2h后再灌服藥物1次。皮下注射異丙腎上腺素24h后摘除大鼠心臟,進行各項檢測。1.4免疫組織化學心肌組織切片制備:取出心臟標本于4%多聚甲醛中固定24h(4℃),常規(guī)石蠟包埋,切片數(shù)張,分別作HE染色、細胞凋亡及免疫組織化學染色法檢測。1.4.1關(guān)于心肌組織病理學的觀察光鏡下觀察心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。1.4.2bax和bcl-2基因表達的表達心肌細胞凋亡按末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導的帶熒光的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)標記凋亡細胞核的3’末端。細胞核或胞漿中有棕黃色顆粒的為陽性細胞。Bax和Bcl-2基因的蛋白表達按試劑盒說明書免疫組織化學染色法檢測。細胞漿內(nèi)見棕黃色顆粒沉著為陽性表達。將凋亡和免疫組化切片于光鏡下放大400倍,隨機選擇10個視野,分別測定陽性細胞百分比,計算細胞凋亡指數(shù)(AI)和蛋白陽性表達指數(shù)(PEI)。1.5+標準差xs的解釋用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件分析處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)+標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。多組間比較用單因素方差分析,兩兩比較用q檢驗,以P<0.05為有顯著性差異,P<0.01為有非常顯著性差異。2結(jié)果2.1病理組織學檢測參照Rona方法對心肌病理損傷程度進行分級分析。生理鹽水對照組心肌細胞未見明顯變性與壞死,為0度;異丙腎上腺素缺血組見心肌組織呈灶性壞死,偶見灶間相互連接,組織病理損傷程度為Ⅱ-Ⅲ度;復(fù)方丹參片對照組多見點片狀壞死,雜以灶性壞死,病理損傷程度多為Ⅱ度;心腦脈絡(luò)復(fù)元湯干預(yù)組也可見心肌壞死灶形成,但多為點片狀壞死,病理損傷程度多為Ⅰ度。2.2復(fù)方丹參片對心肌凋亡的影響生理鹽水對照組僅見極少數(shù)散在性細胞凋亡存在,Bax蛋白和Bcl-2蛋白雖有表達,但量很低。異丙腎上腺素缺血組見灶性心肌壞死周圍有明顯的心肌細胞凋亡現(xiàn)象,心肌細胞Bax基因的蛋白表達也明顯上調(diào),心肌細胞Bcl-2蛋白表達也有所增加。復(fù)方丹參片對照組有較多的心肌凋亡細胞,Bax蛋白表達上調(diào)較高,Bcl-2蛋白表達仍較低。與之相比,心腦脈絡(luò)復(fù)元湯干預(yù)組心肌凋亡細胞數(shù)量明顯減少,Bax蛋白表達明顯降低,Bcl-2蛋白表達明顯升高。見表1。3心腦絡(luò)復(fù)元湯干預(yù)大鼠心肌凋亡的機制用大劑量異丙腎上腺素注射可引起大鼠心肌細胞變性與壞死,壞死病灶多位于心尖部心內(nèi)膜下,其光鏡下病理改變類似于缺血性心肌壞死。大劑量異丙腎上腺素可引起部分心肌細胞凋亡,凋亡細胞主要位于心肌壞死灶周邊區(qū)。異丙腎上腺素是一種β受體興奮劑,通過激動心臟β1受體,增加心肌收縮力,加快心率。大劑量注射異丙腎上腺素后,心肌需氧量明顯增加而供氧量明顯減少,需氧、供氧失去平衡,導致心肌相對和絕對缺血缺氧。過量的異丙腎上腺素尚可引起細胞內(nèi)鈣離子濃度增高,使ATP分解并激活磷酸酶致線粒體出現(xiàn)不可逆性損傷,終致心肌細胞壞死。細胞凋亡是程序性細胞死亡方式,不同于細胞壞死的生理死亡過程。心肌細胞凋亡參與許多生理和病理生理過程,是多種心血管疾病發(fā)生與演變的細胞學基礎(chǔ)。異丙腎上腺素誘導心肌細胞凋亡的機制,同樣與異丙腎上腺素致心肌細胞缺血缺氧有關(guān),因心肌細胞缺血缺氧可導致心肌細胞凋亡;心肌細胞凋亡的機制還與細胞內(nèi)鈣離子濃度增高有關(guān),胞內(nèi)鈣超載不僅是致心肌變性壞死的重要因素,在誘導心肌細胞凋亡中也具有重要意義。細胞凋亡具有復(fù)雜的分子調(diào)控機制,受一系列基因及其表達產(chǎn)物的有序調(diào)控,而且基因間還存在正負調(diào)節(jié)和相互作用。Bax和Bcl-2分別是促進細胞凋亡的基因和抑制細胞凋亡的基因。Bax高表達時,凋亡指數(shù)高,Bax低表達或不表達時,凋亡指數(shù)低;相反bcl-2高表達,則凋亡指數(shù)低,bcl-2低表達或不表達,則凋亡指數(shù)高。本研究中,光鏡下觀察心腦脈絡(luò)復(fù)元湯干預(yù)組病理損傷程度較異丙腎上腺素缺血組明顯減輕,TUNEL法檢測心腦脈絡(luò)復(fù)元湯干預(yù)組心肌凋亡細胞數(shù)量較異丙腎上腺素缺血組也明顯減少。以上檢測結(jié)果不僅進一步證實了心肌細胞凋亡在心肌缺血損傷病理改變中起了不可忽視的作用,而且似可闡明,通過阻斷或抑制心肌細胞發(fā)生凋亡可能是心腦脈絡(luò)復(fù)元湯發(fā)揮顯著的保護缺血損傷心肌作用的主要機制之一。進一步對凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的蛋白表達的觀察顯示,異丙腎上腺素缺血組大鼠心肌細胞Bax基因的蛋白表達明顯上調(diào),而心肌細胞Bcl-2蛋白表達也有所增加;心腦脈絡(luò)復(fù)元湯干預(yù)組大鼠心肌細胞Bax蛋白表達顯著減少,而Bcl-2蛋白表達則明顯增加。以上結(jié)果表明,心腦脈絡(luò)復(fù)元湯對心肌缺血損傷時凋亡相關(guān)基因的蛋白表達具有顯著的調(diào)節(jié)作用。通過調(diào)節(jié)缺血心肌Bax、Bcl-2基因的蛋白表達,從而抑制和阻斷細胞凋亡的發(fā)生,可能是中藥心腦脈絡(luò)復(fù)元湯防治冠心病