細菌內(nèi)毒素檢查法講義

細菌內(nèi)毒素檢查法

1整理ppt背景介紹：一、細菌內(nèi)毒素二、熱原三、鱟2整理ppt一、細菌內(nèi)毒素細菌內(nèi)毒素是一種革蘭氏陰性細菌細胞壁的產(chǎn)物，當其死亡或菌體裂解時釋放出的一類具有多種生物活性的毒性物質(zhì)3整理ppt特性：〔1〕.致熱性：內(nèi)毒素作用人體細胞，使之釋放內(nèi)源性熱原，刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱反響。〔2〕.耐熱性：需250度干熱30分鐘才能徹底滅活?！?〕.分子極性：多糖鏈親水，脂肪鏈疏水，在水中呈不均勻分布?！?〕.鱟反響：能與鱟試劑發(fā)生多級酶促反響，形成凝膠。4整理ppt二、熱原熱原是指臨床上引起哺乳動物發(fā)熱反響的物質(zhì)細胞分裂素〔IL-1,IL-2,IL-6,IL-8〕內(nèi)源性熱原產(chǎn)生細胞分裂素的物質(zhì)內(nèi)毒素熱原外源性熱原非內(nèi)毒素熱原〔病毒、細菌、真菌、抗體-抗原復合物、細胞分裂素〕5整理ppt熱原和內(nèi)毒素的關(guān)系：熱原是否就是內(nèi)毒素？在學術(shù)上仍有爭議，熱原不僅是細菌內(nèi)毒素。但在藥檢的范疇，細菌內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說無內(nèi)毒素就無熱原，控制內(nèi)毒素就是控制熱原。6整理ppt三、鱟鱟(horseshoecrab)是一類與三葉蟲(現(xiàn)在只有化石)一樣古老的動物。鱟的祖先出現(xiàn)在地質(zhì)歷史時期古生代的泥盆紀，當時恐龍尚未崛起，原始魚類剛剛問世，隨著時間的推移，與它同時代的動物或者進化、或者滅絕，而惟獨只有鱟從4億多年前問世至今仍保存其原始而古老的相貌，所以鱟有“活化石〞之稱。又具有很高的藥用價值。7整理ppt鱟8整理ppt鱟試劑鱟的血液中含有銅離子，它的血液是藍色的。鱟血液顏色呈藍色，是因為鱟血漿的主要成分是血藍蛋白。這種藍色血液的提取物——“鱟試劑〞。鱟試劑是由海洋生物鱟的血液提取物制成的“鱟試劑〞，能夠準確、快速地檢測人體是否因細菌感染而致??；鱟試劑在制藥行業(yè)中，用于檢測細菌內(nèi)毒素。目前使用的鱟試劑分為美洲鱟試劑和東方鱟鱟試劑兩大類。9整理ppt2021年版藥典細菌內(nèi)毒素

檢查法介紹整體結(jié)構(gòu)1.綜述局部檢查法的描述試驗的準備限值〔L〕確實定確定最大有效稀釋倍數(shù)〔MVD〕2.實驗局部凝膠法 光度測定法a鱟試劑靈敏度復核 a標準曲線的可靠性實驗b干擾實驗 b干擾實驗c檢查法：限量試驗 c檢查法半定量試驗 10整理ppt綜述局部1.檢查法的描述2.試驗的準備3.限值〔L〕確實定4.確定最大有效稀釋倍數(shù)〔MVD〕11整理ppt細菌內(nèi)毒素檢查法的定義：本法是利用鱟試劑與細菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反響的機理，以判斷供試品中的細菌內(nèi)毒素限度是否符合規(guī)定的一種方法。12整理ppt細菌內(nèi)毒素檢查法介紹細菌內(nèi)毒素檢查包括：限量實驗?zāi)z法半定量實驗可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準。

濁度法動態(tài)濁度法光度測定法終點濁度法顯色基質(zhì)法動態(tài)顯色法終點顯色法

13整理ppt試驗的準備實驗所需物品細菌內(nèi)毒素標準物質(zhì)細菌內(nèi)毒素檢查用水凝膠法鱟試劑漩渦混合器適宜的恒溫器37±1℃電熱枯燥箱250℃實驗器械等14整理ppt細菌內(nèi)毒素標準物質(zhì)a國家標準品以內(nèi)毒素國際標準品為基準標定效價。系自大腸埃系菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內(nèi)毒素工作標準品的效價。150600-20070710000EU/支b工作標準品以內(nèi)毒素國家標準品為基準標定效價。用于試驗中鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗及各種陽性對照。150601-202168150EU/支150601-202172120EU/支15整理ppt細菌內(nèi)毒素檢查用水用于復溶內(nèi)毒素標準品、稀釋內(nèi)毒素及樣品、溶解鱟試劑等a凝膠法細菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水b光度測定法細菌內(nèi)毒素檢查用水，其內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.005EU/ml16整理ppt17整理ppt漩渦混合器18整理ppt漩渦混合器19整理ppt干熱恒溫器20整理ppt恒溫水浴21整理ppt試驗器械移液管〔或刻度吸管、微量加樣器及無熱原吸頭〕、凝集管〔10×75mm〕、試管、試管架、洗耳球、封口膜、計時器、75%酒精棉、剪刀、砂輪。試驗的準備

22整理ppt試驗的準備

試驗器械的要求試驗所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分鐘，也可采用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。假設(shè)使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應(yīng)防止微生物是污染。23整理ppt試驗的準備供試品溶液的制備某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液〔或其稀釋液〕的pH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)毒素和干擾因子。24整理ppt限值〔L〕確實定藥品、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值〔L〕除藥典有規(guī)定的，一般按以下公式確定：L＝K／MK為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5EU/(kg·h)，放射性藥品注射劑K=2.5EU/(kg·h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kg·h)；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示，人均體重按60kg計算，人體外表積按1.62㎡計算。注射時間假設(shè)缺乏1小時，按1小時計算。供試品每平方米體外表積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量〔M〕按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。25整理ppt限值計算時做必要調(diào)整的幾種情況從嚴原那么聯(lián)合用藥特殊情況等限值〔L〕確實定26整理ppt確定最大有效稀釋倍數(shù)〔MVD〕最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。MVD＝cL／λ

L：供試品的內(nèi)毒素限值

c：供試品溶液的濃度

λ：在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度(EU/ml)，或在光度測定法中所使用的標準曲線上最低的內(nèi)毒素濃度(如標準曲線為50、5、

0.5EU/ml三個濃度組成)27整理ppt計算舉例a當L以EU/ml表示時，那么濃度C的單位為1.0ml/ml適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應(yīng)小于xxEU/ml。

例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗，那么：MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.125EU/ml＝4倍確定最大有效稀釋倍數(shù)〔MVD〕28整理ppt計算舉例b當L以EU/mg表示時，那么C的單位為mg/ml或U/ml適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液體但是規(guī)定限值為應(yīng)小于xxEU/mg或EU/U。例：注射用阿莫西林鈉計算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進行檢驗。需先稱取一定重量的注射用阿莫西林鈉，在已除去外源性內(nèi)毒素的容器中，用細菌內(nèi)毒素檢查用水配制成一定濃度的溶液。如稱取100mg注射用阿莫西林鈉，用5ml內(nèi)毒素檢查用水溶解，即成為濃度為20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。MVD＝20mg/ml×0.15EU/mg÷0.25EU/ml＝12倍29整理ppt如果供試品為注射用無菌粉末或原料藥，那么MVD取1，計算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L；適用于供試品為固體的情況。計算得到的最小有效稀釋濃度即為MVD下的該供試品的濃度。例：注射用阿莫西林鈉計算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗。最小有效稀釋濃度c＝0.125EU/ml÷0.15EU/mg＝0.833mg/ml30整理ppt實驗局部凝膠法光度測定法a鱟試劑靈敏度復核a標準曲線的可靠性實驗b干擾實驗b干擾實驗c檢查法：限量試驗c檢查法

半定量試驗31整理ppt目的－考察鱟試劑的靈敏度是否準確－考察檢驗人員操作方法是否正確－實驗條件是否符合規(guī)定何時進行－使用新批號的鱟試劑－試驗條件發(fā)生可能影響檢驗結(jié)果的改變時

鱟試劑靈敏度復核試驗32整理ppt實驗操作:取細菌內(nèi)毒素國家標準品或工作標準品一支，參加規(guī)定量的細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋，制備成4個濃度的細菌內(nèi)毒素標準溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ〔λ為所復核的鱟試劑的標示靈敏度〕，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘。33整理ppt鱟試劑靈敏度復核試驗

內(nèi)毒素濃度2λλ0.5λ0.25λ陰性對照鱟試劑平行管○○○○○○○○○○○○○○○○○○34整理ppt鱟試劑靈敏度復核試驗放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，假設(shè)管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；形成的凝膠不堅實、變形或從管壁滑脫者為陰性；保溫和拿取試管過程應(yīng)防止受到振動造成假陰性結(jié)果。35整理ppt堅實凝膠陽性“+〞36整理ppt未形成凝膠凝膠不堅實陰性“—〞37整理ppt結(jié)果判斷：假設(shè)最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管陰性，試驗方有效。結(jié)果計算：反響終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值λc=lg-1(ΣX/4)式中X為反響終點濃度的對數(shù)值〔lg〕?！卜错懡K點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度?！橱c試劑靈敏度復核試驗38整理ppt鱟試劑靈敏度復核試驗內(nèi)毒素濃度2λλ0.5λ0.25λ陰性對照終點鱟試劑平行管●●○○○λ●●○○○λ●●●○0.5λ●●●○0.5λλc=lg-1[(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)/4]=0.707λ39整理ppt當λc在0.5λ～2λ〔包括0.5λ和2λ〕時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查。實驗時，以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。鱟試劑靈敏度復核試驗40整理ppt凝膠法干擾試驗?zāi)康模菏谴_定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反響不存在干擾作用，為能否使用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。41整理ppt凝膠法干擾試驗當進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾試驗?！沧ⅲ喉毴齻€批號以上的供試品，兩個以上鱟試劑廠家的試劑〕當鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。如：內(nèi)毒素檢查時，供試品陽性對照為陰性時。42整理ppt凝膠法干擾試驗預試驗正式干擾試驗43整理ppt目的：初步確定供試品的最大不干擾濃度〔當限值以EU/mg或EU/U活性單位表示〕或最小不干擾稀釋倍數(shù)〔當限值以EU/ml表示〕，為正式干擾實驗提供依據(jù)；優(yōu)點：減少摸索過程、節(jié)省本錢。預試驗44整理ppt操作步驟：將供試品溶液進行一系列倍數(shù)的稀釋；使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進行檢驗，每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和4支供試品陽性對照〔即含2.0λ和0.25λ濃度標準內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液〕；另做2支陰性對照和2支陽性對照。預試驗45整理ppt預試驗結(jié)果判斷：當陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實驗為有效；當系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，供試品陽性對照0.25λ管均為陰性時，認為供試品在該濃度下不干擾實驗，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。即可選擇該稀釋倍數(shù)和相鄰濃度進行正式干擾實驗。預試驗46整理ppt正式干擾試驗

目的：檢驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反響有無干擾作用。通過比較鱟試劑與在水溶液中的內(nèi)毒素和供試品溶液中的內(nèi)毒素反響的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對內(nèi)毒素檢查有干擾。47整理ppt正式干擾試驗操作：用內(nèi)毒素檢查用水和供試品將同一支內(nèi)毒素標準品分別制備一系列濃度的內(nèi)毒素溶液操作：內(nèi)毒素檢查用水同一支內(nèi)毒素標準品供試品溶液同時制備2支供試品陰性對照和2支陰性對照。

含2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標準溶液含2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素的供試品溶液

48整理ppt編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶劑稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液－－－2B2λ/供試品溶液供試品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/檢查用水檢查用水12λ421λ440.5λ480.25λ4D無/檢查用水－－－2A：供試品溶液B：供試品陽性對照C：陽性對照D：陰性對照49整理ppt結(jié)果判斷當供試品陰性對照A和陰性對照D都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時，試驗方為有效。分別計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標準溶液的反響終點濃度的幾何平均值〔ES〕和用供試品溶液和稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反響終點濃度的幾何平均值〔Et〕；ES=lg-1(ΣXS/4)Et=lg-1(ΣXt/4)當ES在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5ES～2ES〔包括0.5ES和2ES〕時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。50整理ppt內(nèi)毒素濃度2.0λλ0.5λ0.25λ終點內(nèi)毒素/檢查用水（系列溶液C）●●○○λ●●○○λ●●○○λ●●○○λ陰性對照（溶液D）○○內(nèi)毒素/供試品溶液（系列溶液B）●●○○λ●●○○λ●○○○2.0λ●○○○2.0λ供試品陰性對照（溶液A）○○

ES=lg-1(ΣXS/4)＝λEt=lg-1(ΣXt/4)＝1.41λ51整理ppt當存在干擾時，可通過對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或有關(guān)其他適宜的方法〔如過濾、中和、透析或加熱處理等〕排除干擾。導致干擾的因素：排除干擾的方法：pH值稀釋抗凝因子中和螯合劑過濾葡聚糖加熱52整理ppt凝膠法干擾試驗由于干擾實驗檢驗的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反響是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無關(guān)，因此在干擾實驗中原那么上可使用任一靈敏度的鱟試劑。建議使用較低靈敏度〔如0.5或0.25EU/ml〕的鱟試劑，可盡量防止供試品所含的內(nèi)毒素對干擾實驗造成的陽性影響。53整理ppt檢查法－凝膠法凝膠限度試驗?zāi)z半定量試驗54整理ppt凝膠限度試驗檢驗供試品中的內(nèi)毒素含量是否小于限度的定性方法。編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A供試品溶液無/供試品溶液2B供試品陽性對照2λ/供試品溶液2C陽性對照2λ/檢查用水2D陰性對照無/檢查用水2當陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效55整理ppt例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算：

MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.25EU/ml＝2倍供試品溶液：2倍替硝唑稀釋液供試品陽性對照為：含0.25EU/ml標準內(nèi)毒素的2倍替硝唑稀釋液陽性對照為：濃度為0.25EU/ml的標準內(nèi)毒素溶液56整理ppt凝膠限度試驗結(jié)果判斷供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照○○●●○○●●試驗有效57整理ppt凝膠限量試驗結(jié)果判斷供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照○○●●○○●●此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量小于0.5EU/ml，符合規(guī)定供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照●●●●○○●●此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量不小于0.5EU/ml，不符合規(guī)定58整理ppt凝膠限量試驗結(jié)果判斷供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照○●●●○○●●須復試復試時，供試品溶液需做4支平行管，假設(shè)所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；四管中如有一管為陽性，即可判供試品不符合規(guī)定。供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照○○○○●●○○●●59整理ppt凝膠半定量試驗半定量試驗是使用凝膠法估測供試品中內(nèi)毒素含量的方法，系通過反響終點濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。原理：通過供試品系列稀釋液與鱟試劑反響，其反響終點濃度的稀釋倍數(shù)與鱟試劑靈敏度的乘積即為供試品的內(nèi)毒素含量。60整理ppt凝膠半定量試驗操作：用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度和稀釋倍數(shù)下開始進行對倍稀釋，制備成2、4、8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數(shù)不得超過所使用鱟試劑的MVD。61整理ppt凝膠半定量試驗溶液的制備編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶劑稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水1－22－24－28－2B2λ/供試品溶液2λ2C2λ/檢查用水檢查用水12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/檢查用水－－－2A：沒有超過MVD并且通過干擾試驗的供試品系列稀釋液；B：供試品陽性對照（為確證不存在干擾作用）；C：標準內(nèi)毒素系列（為確證本試驗的操作和環(huán)境都符合規(guī)定）；D：陰性對照。62整理ppt凝膠半定量試驗－結(jié)果判斷當陰性對照溶液D的平行管均為陰性；供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性；系列溶液C的反響終點濃度的幾何平均值在0.5λ～2λ之間，那么試驗有效。假設(shè)內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限度，判供試品符合規(guī)定。假設(shè)內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限度，判供試品不符合規(guī)定。63整理ppt凝膠半定量試驗－結(jié)果計算內(nèi)毒素濃度2.0λλ0.5λ0.25λ終點標準內(nèi)毒素系列溶液C●●●○0.5λ●●○○λ稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A●●●○4×λ●●○○2×λ供試品陽性對照溶液B●●陰性對照溶液D○○CE＝lg-1(ΣX/2)=lg-1[(lg4λ+lg2λ)/2]=2.83λ64整理ppt例：右旋糖酐20葡萄糖注射液，限值為0.5EU/ml；通過使用3個鱟試劑廠家的鱟試劑對3個不同廠家的7個樣品進行干擾試驗證實：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀釋2倍后即不干擾內(nèi)毒素檢查；使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑對一批右旋糖酐20葡萄糖注射液進行凝膠半定量試驗。MVD＝0.5EU/ml÷0.03EU/ml＝16.67倍從已確定不干擾的稀釋倍數(shù)2倍起，再進行1、2、4、8倍稀釋(相當于將供試品原液進行了2、4、8、16倍稀釋，最終的稀釋倍數(shù)沒有超MVD)。65整理ppt內(nèi)毒素濃度0.060.030.0150.0075終點標準內(nèi)毒素系列溶液C●●●○0.015●●○○0.03稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A●●●○4×0.03●●○○2×0.03供試品陽性對照溶液B●●陰性對照溶液D○○CE＝lg-1(ΣX/2)=lg-1[(lg4λ+lg2λ)/2]=2.83λ＝0.0849EU/ml66整理ppt如果檢驗時采用的是供試品的稀釋液，那