Weastern Blot 操作方法 圖文

蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)為什么要作蛋白質(zhì)印跡實驗？

目的蛋白的表達特性分析目的蛋白與其它蛋白的互作目的蛋白的組織定位目的蛋白的表達量分析WesternBlot簡介WesternBlot一般流程WesternBlot常見問題分析單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。原理：在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測WesternBlot簡介。1、蛋白樣品的制備2、SDS3、轉(zhuǎn)膜4、封閉5、一抗雜交6、二抗雜交7、底物顯色WesternBlot流程通過有機溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。有機溶劑提取法對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過層析或電洗脫法制備目的蛋白1.1蛋白樣品的提取1、蛋白樣品的制備1.2蛋白樣品的定量目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、BCA法等。但各有優(yōu)缺點，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。BCA法R值1.3蛋白樣品的變性2×SDS上樣緩沖液：1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚藍0.2g總體積100mlSDS

是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。強還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負電荷的量遠遠超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)。2.1基本原理2、SDS電泳

PAGE：

聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W惰性強，具有一定的機械強度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。2.2凝膠成分丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺

SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨Tris-甘氨酸電泳緩沖液單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；催化劑：過硫酸胺或核黃素（AP）；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠2.3凝膠濃度與蛋白分離范圍SDS濃縮膠(5%Acrylamide)及分離膠配方表：/sdskit.htm

作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小灌制分離膠隔絕空氣灌制積層膠插入梳子

StakinggelSeparatinggel電泳條件：推薦：濃縮膠80V15——25min

分離膠120V60——80min2.3marker的選擇預混分子量標準高分子量標準低分子量標準寬分子量標準預染分子量標準單色預染多色預染修飾分子量標準原因：校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差種類：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin用法：二抗孵育時加入HRP標記內(nèi)參抗體分子量大小相差比較明顯

2.4內(nèi)參的選擇要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。3、轉(zhuǎn)膜3.1膜的選擇濕轉(zhuǎn)半干轉(zhuǎn)半干式轉(zhuǎn)膜速度快，適合與小分子量蛋白濕式成功率高并特別適合用于分子量大于100KD的蛋白兩種方法的轉(zhuǎn)膜液不同??！方法儀器特點4、封閉為防止一抗或/和二抗與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的高背景，因此需要進行膜的封閉，常用的封閉液：脫脂奶粉（5％）封閉條件：室溫封閉1hour，再用TBST洗5秒，進入下一步抗體的孵育。5-6、一二抗雜交把PVDF膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，按照抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)，用TBST稀釋抗體；搖床上平緩搖動，于室溫孵育1-2小時或4℃過夜?；厥找豢谷芤?，用TBST漂洗膜3次，每次15min。加入TBST配制的二抗，搖床上緩慢搖動，于室溫孵育1-2小時或4℃過夜?；厥斩谷芤?，用TBST漂洗膜3次，每次15min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。7、底物顯色顯色方法代表類型特點酶促底物發(fā)光法DAB顯色法穩(wěn)定性好，靈敏度較高（250pg），背景一般，成像性較差，藥品疑有一定致癌性。

化學發(fā)光法（推薦使用）ECL發(fā)光法穩(wěn)定性好，靈敏度高（10-12g），背景可以很低，成像性好，且可以重復標記，暗室操作！A液B液11:

膜混合ECL工作液滴加ECL工作液

顯影、定影目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。WesternBlot常見問題分析SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入AP和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適SDS電泳轉(zhuǎn)膜及抗體檢測凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少蛋白分子量<

10KDSDS濃度不合適凝膠太厚

原因?qū)Σ叩鞍追肿恿?lt;10KD時，減少轉(zhuǎn)膜時間；使用小孔徑的膜在陰極buffer中加入0.005-0.01%SDS可提高轉(zhuǎn)膜效率延長轉(zhuǎn)膜時間膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過高

原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度背景太高雜交信號很弱抗體保存不當抗原不充足膜的漂洗過度

原因?qū)Σ呖贵w長期保存應(yīng)在－70℃，使用前做效價檢測增加蛋白上樣量，做已知標準量蛋白的對照減少漂洗的時間和次數(shù)一抗不是唯一特異的二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合

原因?qū)Σ咧苽鋯慰寺】贵w或者重新選取合成抗原多肽的位點設(shè)立不加一抗，只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異結(jié)合出現(xiàn)非特異帶FurtherReadings生物秀WesternBlotti