層粘連蛋白β1與塵肺病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及其機(jī)制的初探

層粘連蛋白β1與塵肺病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及其機(jī)制的初探塵肺病(pneumoconiosis)是由于長(zhǎng)期吸入生產(chǎn)性粉塵并在肺內(nèi)潴留而導(dǎo)致的以肺組織不可逆性纖維化為主的全身性疾病,是我國(guó)危害最嚴(yán)重、涉及人數(shù)最多的職業(yè)病,其中最常見的兩種類型是矽肺(silicosis)和煤工塵肺(coalworkers’pneumoconiosis,CWP)。井下煤礦作業(yè)人群的煤工塵肺以混合性塵肺-煤矽肺為多見,占87.6%,單純的矽肺病和煤肺病很少,分別為11.4%和1.0%。2013年我國(guó)共報(bào)告了新增塵肺病例23152例,占全年新發(fā)職業(yè)病的87.72%,其中95.2%是矽肺病和煤工塵肺。塵肺病發(fā)生發(fā)展的病因、機(jī)制復(fù)雜,難以完全闡明,塵肺病一個(gè)重要的病理特征是,細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積。其中層粘連蛋白是一類具有多功能域的基底膜非膠原糖蛋白,由α、β、γ鏈構(gòu)成的異三聚體,參與基底膜骨架的組裝,影響和調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附、遷移、分化、增殖等生物學(xué)行為,也參與細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)。層粘連蛋白β1鏈(LamB1)由LAMB1基因編碼,在體內(nèi)分布廣泛,參與組裝至少7種層粘連蛋白亞型。LamB1是肺發(fā)育和維持正常功能所必需的,也被報(bào)道參與腎、肝纖維化過(guò)程。然而,關(guān)于LamB1與塵肺的研究報(bào)道較少。雖然長(zhǎng)期粉塵暴露是塵肺病的主要病因,但相同暴露條件下,發(fā)病率、病變進(jìn)展快慢及纖維化嚴(yán)重程度的差異提示遺傳因素在塵肺的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。單核苷酸多態(tài)性是研究疾病遺傳易感性的重要工具,可反應(yīng)個(gè)體表型、疾病易感性及對(duì)藥物、環(huán)境等影響因素反應(yīng)的差異。前期對(duì)塵肺病進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS),發(fā)現(xiàn)在LAMB1基因上一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs4320486與塵肺病的發(fā)生危險(xiǎn)性存在著相關(guān)性。鑒于塵肺病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚無(wú)有效治療,且缺乏人群特異的血清學(xué)指標(biāo),深入研究基因多態(tài)性與塵肺病間遺傳易感性的關(guān)系,對(duì)建立有效的易感性篩查,提高粉塵接觸人群的健康監(jiān)護(hù)水平都具有實(shí)際意義。目的在前期對(duì)塵肺病進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)研究(gwas)的基礎(chǔ)上,通過(guò)大樣本的病例-對(duì)照研究驗(yàn)證lamb1rs4320486與塵肺病發(fā)生危險(xiǎn)性間的關(guān)聯(lián);通過(guò)人群血清樣本、細(xì)胞模型研究rs4320486位點(diǎn)突變對(duì)lamb1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響;通過(guò)動(dòng)物模型和體外細(xì)胞模型觀察lamb1在纖維化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及可能的調(diào)控機(jī)制,為揭示塵肺病發(fā)病機(jī)制、個(gè)性化預(yù)防及治療提供線索。方法(1)對(duì)1091例cwp患者和1042例無(wú)塵肺接塵對(duì)照進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查,包括一般人口學(xué)資料、接塵史、家族史等,并采集空腹外周靜脈血,采用taqman基因分型法對(duì)受試者基因進(jìn)行分型;(2)構(gòu)建包含rs4320486(c>t)不同等位基因的載體,建立細(xì)胞模型,采用雙熒光素酶報(bào)告基因發(fā)檢測(cè)不同等位基因?qū)amb1基因轉(zhuǎn)錄的影響;(3)采用酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)檢測(cè)不同基因間、病例和對(duì)照間血清lamb1濃度;(4)收集正常人肺組織和纖維化人肺組織,qrt-pcr法檢測(cè)組織中l(wèi)amb1mrna表達(dá)水平的差異;(5)分別建立sio2和blm誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型,對(duì)處理后不同時(shí)間截點(diǎn)的小鼠肺組織病理切片進(jìn)行he染色,觀察不同時(shí)間點(diǎn)肺纖維化發(fā)生發(fā)展情況,以確認(rèn)模型成功建立;(6)分別提取各期小鼠肺組織蛋白和rna,檢測(cè)lamb1、上皮標(biāo)志物e-cadherin、及間質(zhì)標(biāo)志物α-sma蛋白及mrna水平的動(dòng)態(tài)變化;(7)建立sio2處理hbe細(xì)胞模型和tgf-β1誘導(dǎo)nih-3t3細(xì)胞模型,誘導(dǎo)纖維化病變,通過(guò)westernblot和qrt-pcr法確認(rèn)lamb1與上皮間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)情況,細(xì)胞免疫熒光直觀展示hbe、nih-3t3細(xì)胞中纖維化表達(dá)的變化;(8)通過(guò)抑制劑特異性阻斷活化的信號(hào)通路,研究纖維化中調(diào)控lamb1表達(dá)的機(jī)制。(9)應(yīng)用epidata對(duì)人群調(diào)查建立數(shù)據(jù)庫(kù),spss16.0、stata12.0、plink1.07用于數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計(jì)分析。使用imagej進(jìn)行westernblot條帶灰度值掃描,圖形由graphpad5.0軟件完成。結(jié)果1.采用logistic回歸分析,以cc基因型為參照,lamb1rs4320486ct/tt基因型可以顯著降低cwp的發(fā)生危險(xiǎn)性(p=0.001),調(diào)整年齡、累積粉塵暴露量(cde)、吸煙后or值為0.74,95%ci為0.62~0.88。攜帶t等位基因的個(gè)體發(fā)生cwp的危險(xiǎn)性是攜帶c等位基因個(gè)體的0.76倍(p<0.001)。分層分析顯示,ct/tt基因型降低cwp發(fā)生危險(xiǎn)性的保護(hù)性效應(yīng),在年齡>68歲組、低cde組及吸煙組人群中更加明顯。此外,采用cox回歸分析不同基因型與cwp病例從接塵到發(fā)病間期的關(guān)聯(lián)性,發(fā)現(xiàn)ct/tt基因型可以延緩cwp的發(fā)生(p<0.001)。2.從細(xì)胞和人群兩個(gè)方面觀察分析不同等位基因?qū)amb1表達(dá)的影響。轉(zhuǎn)染rs4320486pgl3-c等位基因質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性顯著高于轉(zhuǎn)染pgl3-t組細(xì)胞(p<0.05),在hbe細(xì)胞中約為3.6倍,在mrc-5細(xì)胞中約1.2倍。此外,elisa檢測(cè)48例接塵人員血清lamb1濃度顯示,相同基因型下,病例組的血清濃度高于對(duì)照組;在同為病例或同為對(duì)照組中,cc基因型個(gè)體血清lamb1濃度均略高于ct/tt基因型個(gè)體。這些結(jié)果提示不同基因型會(huì)影響lamb1表達(dá)水平的。3.用qrt-pcr檢測(cè)肺組織中l(wèi)amb1的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)cwp患者和特發(fā)性肺纖維化(ipf)患者肺組織中l(wèi)amb1的表達(dá)水平顯著高于正常人肺組織(p<0.05),分別是對(duì)照的2.7倍和2.3倍。4.在建立的blm和sio2誘導(dǎo)的c57bl/6小鼠兩種肺纖維化模型中,小鼠肺組織lamb1與間質(zhì)標(biāo)志物-α-sma的蛋白與mrna水平均隨著纖維化的發(fā)生發(fā)展呈進(jìn)行性增高,而上皮細(xì)胞標(biāo)志物-e-cadherin則呈下降趨勢(shì)。5.在sio2處理hbe和tgf-β1處理nih-3t3的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,進(jìn)一步驗(yàn)證了在肺組織中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果,處理后可觀察到lamb1的蛋白水平和mrna水平均顯著增加,且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),一直保持高水平。細(xì)胞免疫熒光更直觀的展示,與對(duì)照組相比,兩個(gè)處理組lamb1的表達(dá)強(qiáng)度和范圍均增加。6.sio2處理hbe后pi3k-akt信號(hào)通路和tgf-β/smad信號(hào)通路中下游分子均有表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì),給予pi3k抑制劑ly294002和tgf-β受體1拮抗劑(tβri)ly2157299后,p-akt、p-smad2和smad2表達(dá)下調(diào),lamb1的蛋白水平也相應(yīng)減少,尤其是在ly2157299抑制劑組。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)lamb1基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)rs4320486的突變會(huì)降低cwp的發(fā)生危險(xiǎn)