抱子甘藍(lán)組織培養(yǎng)快繁技術(shù)規(guī)程

1抱子甘藍(lán)組織培養(yǎng)快繁技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了抱子甘藍(lán)組織培養(yǎng)快速繁殖過程中的術(shù)語和定義、培養(yǎng)基制備、組培室消毒滅菌、抱子組培苗生產(chǎn)等方面的技術(shù)規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于抱子組織培養(yǎng)繁殖苗木。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB15/T1939—2020文冠果組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T391綠色食品產(chǎn)地環(huán)境質(zhì)量3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1外植體explant植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段。外植體通常選擇生長(zhǎng)健壯的無病蟲的植株上的正常器官或組織。3.2接種inoculation在無菌條件下將表面滅菌后的外植體或繼代、生根組培材料接入培養(yǎng)基的過程。4培養(yǎng)基配制4.1培養(yǎng)基配方MS培養(yǎng)基：具體成分見附錄A中的表A.1。改良MS培養(yǎng)基，配方為：用Ca（NO3）2?4H2O代替原MS培養(yǎng)基中的CaCl2?2H2O并添加核黃素，其他組分均無變化；在改良MS培養(yǎng)基中Ca（NO3）2?4H2O的濃度為60mg/L，核黃素的濃度為5mg/L。MS制備用于不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，配方為：在所述改良MS培養(yǎng)基上添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）、6-糠基氨基嘌呤（KT）以及吲哚乙酸（IAA在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-芐氨基嘌呤（6-BA）的濃度2IAA）的濃度為0.為0.8mg/L，6-糠基氨基嘌呤（KT）的濃度為0.6mg/L，吲哚乙酸（2mg/L。制備用于繼代增殖的培養(yǎng)基，配方為：在所述改良MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）、6-糠基氨基嘌呤（KT）以及吲哚乙酸（IAA），在繼代增殖培養(yǎng)基中6-芐氨基嘌呤（6-BA）的濃度為1mg/L，6-糠基氨基嘌呤（KT）的濃度為0.5mg/L，吲哚乙酸（IAA）的濃度為0.2mg/L。制備用于無菌生根的培養(yǎng)基，配方為：在所述改良MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加吲哚丁酸（IBA）和吲哚乙酸（IAA），在生根培養(yǎng)基中吲哚丁酸（IBA）的濃度為0.1mg/L，吲哚乙酸（IAA）的濃度為5mg/L。4.1培養(yǎng)基母液及培養(yǎng)基配制按照DB15/T1939—2020執(zhí)行。4.2環(huán)境與器具消毒滅菌按照DB15/T1939—2020執(zhí)行。5組織培養(yǎng)技術(shù)5.1外植體及其消毒選取生長(zhǎng)健康的抱子甘藍(lán)幼嫩的枝條作為外植體；用中性洗滌劑洗滌洗枝條，以去除枝條表面的污垢，然后去除多余的葉片，干凈紙巾吸干表面水分。在超凈工作臺(tái)上，先用70%酒精浸泡10-30s，再用無菌水沖洗3次，每次3-5min。立即轉(zhuǎn)入0.1-0.3%的升汞溶液中消毒5-8min，最后用無菌水洗滌3-5次，每次3-5min，得到消毒外植體。5.2不定芽誘導(dǎo)在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將消毒外植體切割成0.4-0.5cm長(zhǎng)的單芽或雙芽莖段，然后將莖段接種于用于不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基；每瓶接1～3個(gè)外植體，分布均勻，封好瓶口后，注明品種代號(hào)、接種人員及日期等，放至培養(yǎng)室培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)18-22d，得到抱子甘藍(lán)不定芽。誘導(dǎo)培養(yǎng)條件如下：溫度為26±3℃,濕度為80-90%，光照時(shí)間為14h/d，光照強(qiáng)度為800-12001x。5.3繼代增殖將不定芽誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽苗，去除基部愈傷組織及生長(zhǎng)不良的組織，切分成2～4株一簇的小芽叢，接入繼代培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)20-25d，得到抱子甘藍(lán)無菌苗。接種數(shù)量根據(jù)培養(yǎng)容器的大小決定，要求材料擺布均勻，間距1.0cm～2.0cm。繼代增殖培養(yǎng)條件如下：溫度為26±3℃,濕度為50-65%，光照時(shí)間為14h/d，光照強(qiáng)度為800-12001x。35.4無菌生根當(dāng)繼代增殖培養(yǎng)的抱子甘藍(lán)無菌苗生長(zhǎng)到2.0cm-5.0cm時(shí)，進(jìn)行切繁，并保持每株均有一個(gè)不定芽，接入用于無菌生根的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)15-20d，得到抱子甘藍(lán)幼苗。接種數(shù)量根據(jù)培養(yǎng)容器的大小決定，要求材料擺布均勻，間距1.0cm-2.0cm。無菌苗在培養(yǎng)基中的插入深度為5mm-8mm，保持壯苗直立。生根培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為26±3℃,濕度為50-65%，光照時(shí)間為14小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為800-12001x。5.5煉苗當(dāng)組培瓶苗達(dá)到根長(zhǎng)0.5cm、苗高3cm后時(shí)，將其置于溫度為26±3℃,濕度為50-65%，光照時(shí)間為14h/d，光照強(qiáng)度為800-12001x的溫室苗床上，鍛煉3d后，去掉封口膜，再置于溫室內(nèi)小拱棚中，繼續(xù)鍛煉4d。5.6移栽基質(zhì)處理：采用體積比為草炭：蛭石：廢菇料為1:1:1混合物為基質(zhì)?；|(zhì)混合過程中均勻噴入多菌靈800倍液。移栽：用鑷子取出組培瓶苗，在流動(dòng)水下洗去殘留培養(yǎng)基，避免損傷苗根；在口徑9cm、深12cm的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)填裝適量基質(zhì)，將清洗后的組培瓶苗移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中，過程中避免傷根。移栽后置于小拱棚內(nèi)。保持棚內(nèi)溫度25-30℃,澆水遵循見干見濕原則。5.6定植基地環(huán)境質(zhì)量應(yīng)符合NY/T391的規(guī)定。選擇土層厚、土壤肥沃、富含有機(jī)質(zhì)、排灌方便的壤土。定植前2-3天，土壤含水量60%左右時(shí)，667m2選用50%乙草胺乳油100-150mL對(duì)水500kg，噴霧除草。每667m2施優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥4000-5000kg、過磷酸鈣50kg、硫酸鉀20kg作基肥，耕深25-30cm并整平。定植行距70cm，株距45cm，澆定根水1-2次。4（資料性附錄）表A.1MS培養(yǎng)基混合母液配制表母液名稱編號(hào)化試名稱mg/L擴(kuò)大倍數(shù)擴(kuò)大后稱mg母液定容體積mL配置培養(yǎng)基吸取量mL/L大量元素ANH4NO3406600025KNO34076000MgSO4·7H2O3704014800BCaCl2·2H2O44044000CKH2PO417000鐵鹽DFeSO4·7H2O27.82780Na2EDTA·2H2O37.23720微量元素EMnSO4·4H2O22.32230ZnSO4·7H2O8.6860H3BO36.2620有機(jī)成分FKI0.83Na2MoO4·2H2O0.2525CuSO4·5H2O0.0252.5CoCl2·6H2O0.0252.5G甘氨酸22001鹽酸硫胺素B10.1鹽酸吡哆酸B60.550煙酸0.550H肌醇50005005（資料性附錄）抱子甘藍(lán)中文名：抱子甘藍(lán)拉丁學(xué)名：BrassicaoleraceaL.var.gemmiferaZenker別稱：小圓白菜、小卷心菜、芽卷心菜、芽甘藍(lán)分類：十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種植株特征：二年生草本，被粉霜。莖粗壯，直立，高0.5-1米，莖的全部葉腋有大的柔軟葉芽，直徑2-3厘米。二年生莖有分枝，具莖生葉?；~及下部莖生葉長(zhǎng)圓狀倒卵形至圓形，長(zhǎng)和寬達(dá)30厘米。頂端圓形，基部驟窄成極短有寬翅的葉柄，邊緣有波狀不顯明鋸齒;上部莖生葉卵形或長(zhǎng)圓狀卵形，長(zhǎng)8-13.5厘米，寬3.5-7厘米，基部抱莖;最上部葉長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)約4.5厘米，寬約1厘米，抱莖。總狀花序頂生及腋生;花淡黃色，直徑2-2.5厘米;花梗長(zhǎng)7-15毫米;萼片直立，線狀長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)5-7毫米；花瓣寬橢圓狀倒卵形或近圓形，長(zhǎng)13-15毫米，脈紋顯明，頂端微缺，基部驟變窄成爪，爪長(zhǎng)5-7毫米。長(zhǎng)角果圓柱形，長(zhǎng)6-9厘米，寬4-5毫米，兩側(cè)稍壓扁，中脈突出，喙圓錐形，長(zhǎng)6-10毫米;果梗粗，直立開展，長(zhǎng)2.5-3.5厘米。種子球形，直徑1.5-2毫米，棕色。花期4月，果期5月。生存環(huán)境：（1）溫度。抱子甘藍(lán)喜冷涼的氣候,耐寒力很強(qiáng)，在氣溫下降至-4--3℃時(shí)也不致受凍害,能短時(shí)耐―13℃或更低的溫度。抱子甘藍(lán)耐熱性較結(jié)球甘藍(lán)弱,其生長(zhǎng)適溫為18-22℃。小葉球形成期最適溫度為白天15-22℃,夜晚9-10℃,以晝夜溫差10-15℃的季節(jié)或地區(qū)生長(zhǎng)最好。（2）光照。抱子甘藍(lán)屬長(zhǎng)日照植物,但對(duì)光照要求不甚嚴(yán)格。光照充足時(shí)植株生長(zhǎng)旺盛,小芽球堅(jiān)實(shí)而大。在芽球形成期如遇高溫和強(qiáng)光，則不利于芽球的形成。（3）水分。整個(gè)生長(zhǎng)期