第7章微生物遺傳

第五節(jié)微生物原生質(zhì)體交融技術(shù)一、動(dòng)物多核細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和原生質(zhì)體技術(shù)的建二、微生物原生質(zhì)體制備技術(shù)

三、微生物原生質(zhì)體交融

四、微生物原生質(zhì)體的其他用途動(dòng)物多核細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

原生質(zhì)體交融技術(shù)的建立19世紀(jì)初，人們發(fā)現(xiàn)動(dòng)物多核細(xì)胞景象。

后來(lái)研討發(fā)現(xiàn)多核動(dòng)物細(xì)胞的產(chǎn)生往往與病毒感染有關(guān)。

20世紀(jì)中葉，人們用病毒誘導(dǎo)離體條件下動(dòng)物細(xì)胞的交融。

1838Muller動(dòng)物病理組織中發(fā)現(xiàn)多核細(xì)胞1873Lugmbuthl天花病膿胞周?chē)l(fā)現(xiàn)多核細(xì)胞1896Unna水痘損害過(guò)的皮膚中發(fā)現(xiàn)多核細(xì)胞1931Wathin麻疹病人扁桃腺中發(fā)現(xiàn)多核細(xì)胞1954Bndersetal組織培育中發(fā)現(xiàn)麻疹病毒能誘導(dǎo)細(xì)胞用和成多核體1958Marston用副流感病毒誘發(fā)細(xì)胞交融1970Poweretal探求用硝酸鈉誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體交融1972Carlson用NaNO3進(jìn)展了煙草種間原生質(zhì)體交融1972Ferenczyetal以白地霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型為資料經(jīng)原生質(zhì)體交融初次完成異核體構(gòu)成1974Michayluk發(fā)現(xiàn)PEG是一種良好的聚合劑用于原生質(zhì)體交融1976Ferenczyetal以曲霉青霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型為資料經(jīng)原生質(zhì)體交融初次完成異核體構(gòu)成1976Fodoretal宏大芽孢桿菌內(nèi)株間原生質(zhì)體交融勝利1977Hopwood鏈霉菌原生質(zhì)交融并獲交融重組子1978Glebaetal用PEG+高pH-Ca2+研討原生質(zhì)體交融1981Menczel用高pH-Ca2++9℅DMSO與少量PEG獲得較高的交融率1988Kirimalraetal原生質(zhì)體交融獲得黑曲霉二倍體檸檬酸高產(chǎn)菌株P(guān)EG原生質(zhì)體研討的開(kāi)展原生質(zhì)體(protoplast)

植物、大多數(shù)微生物細(xì)胞具有細(xì)胞壁。

采用一定方法技術(shù)去掉細(xì)胞壁，剩下的細(xì)胞部分稱之為原生質(zhì)體。

原生質(zhì)體交融原生質(zhì)體交融包括：原生質(zhì)體制備、

原生質(zhì)體純化

原生質(zhì)體交融

交融子檢出

交融子鑒定①超聲波處置菌體釋放原生質(zhì)體

②酶解脫壁釋放原生質(zhì)體

目前多用酶解法微生物原生質(zhì)體制備放線菌的細(xì)胞壁

二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳糖微生物細(xì)胞壁的組成細(xì)胞壁的組成

微生物種類不同其細(xì)胞壁構(gòu)造和化學(xué)組成不同，酶解處置的有效酶也不一樣，因此要根據(jù)微生物種類特性選擇適宜的酶。

細(xì)菌細(xì)胞壁的構(gòu)造

G+糖肽、底聚糖、多糖、蛋白質(zhì)、磷壁酸、糖醛酸磷壁酸、脂多糖

G-糖肽、磷壁酸、蛋白質(zhì)、類脂、脂多糖、脂蛋白種類纖維素幾丁質(zhì)其它多糖疫霉屬25065毛霉屬0944酵母屬0160鐮刀菌屬03929裂褶菌屬0581鬼傘屬03350真菌的細(xì)胞壁成分自然界中多種生物都能合成破壞降解菌體細(xì)胞壁的酶，如蛋清中的溶菌酶，蝸牛消化道中的消化液中酶類，寄生性微生物合成的有關(guān)酶。

處置細(xì)菌細(xì)胞壁用酶溶菌酶Lysozyme

處置放線菌細(xì)胞壁用酶LyticEnzyme裂解酶、

Lysozyme溶菌酶制備微生物原生質(zhì)體的酶纖維素酶Cellulase

酵母裂解酶Zymolyaseβ1,3葡聚糖酶

幾丁質(zhì)酶Chitinase

商品酶

Novozyme234來(lái)自Trichodermaharzianum

Lywallzyme廣東微生物研討所溶壁酶

Glucuronidase葡聚糖苷酸酶(foryeast)處置真菌用酶①酶種類選擇單一酶的組成

②酶濃度

酶濃度應(yīng)適宜，濃度太高對(duì)原生質(zhì)體有破壞作用，影響原生質(zhì)體的再生。

lysozyme常用濃度0.1~0.2mg/ml

glucuronidase1％

lywallzyme1.5％

③酶解溫度

過(guò)高的溫度會(huì)使酶失活，原生質(zhì)體失活；

過(guò)底的溫度酶活性不高，影響原生質(zhì)體細(xì)膜穩(wěn)定性。原生質(zhì)體釋放有關(guān)的要素菌體培育：液體培育固體培育

搜集菌體：過(guò)濾搜集離心搜集無(wú)菌水沖洗

洗滌菌體：等滲液沖洗等滲液與酶液一樣

酶解處置：保溫酶解，稀釋終止酶解，離心去酶

過(guò)濾分別：過(guò)濾去掉未分解菌絲體

差速離心：搜集大小密度均一的原生質(zhì)體

低速離心棄沉淀物，高速離心棄上清液，得純化原生質(zhì)體。原生質(zhì)體制備程序1．交融親本選育

2．原生質(zhì)體交融操作程序

3．交融子檢出戰(zhàn)略

4．原生質(zhì)體交融操作程序原生質(zhì)體的交融原生質(zhì)體交融是一隨機(jī)過(guò)程，原生質(zhì)體間無(wú)親和選擇性，當(dāng)兩種原生質(zhì)體A和B混合到一同時(shí)，發(fā)生交融的能夠性有A-A、A-B、B-B，其中只需只需A-B的交融是有效交融，概率為33.33％，當(dāng)然還會(huì)有多個(gè)原生質(zhì)體交融到一同的能夠。

此外還存在沒(méi)參與交融的原生質(zhì)體仍保管原來(lái)性狀，要從這個(gè)混合體中挑選出A-B型交融子，往往采取相應(yīng)措施，如親本菌株的遺傳標(biāo)志。在早期微生物原生質(zhì)體混合時(shí)，多采用原生質(zhì)體營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)志，兩者互補(bǔ)恢復(fù)野生型的挑選戰(zhàn)略，還可以選育抗性菌株等遺傳標(biāo)志。

親本選擇是根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩_定的，尤其以育種為目的，但要思索到交融子的挑選。交融親本選育①親本的遺傳標(biāo)志在選擇性培育基上選出再生子，使只需A-B型交融子才能夠再生出來(lái)，而同一種的交融子或未能合的原生質(zhì)體無(wú)法再生。

②原生質(zhì)體滅活誘變形的遺傳標(biāo)志往往也會(huì)使一些有良性狀被喪失，對(duì)以選育消費(fèi)性狀為目的的育種不能實(shí)現(xiàn)。

可以采用滅火原生質(zhì)體的方法作為檢出標(biāo)志，如采用碘代乙酰胺滅活處置真菌原生質(zhì)體，使處置后的原生質(zhì)體失去再生才干，而又對(duì)真菌遺傳特性無(wú)損傷，當(dāng)兩種采用不同滅活劑處置的原生質(zhì)體交融后，可以完成代謝互補(bǔ)，使交融子恢復(fù)再生才干。

③熒光染色在獲得原生質(zhì)體后，分別用不同的熒光素染色親本原生質(zhì)體，隨后交融，交融后于紫外光顯微鏡下挑取交融子?！步蝗谧影l(fā)出兩種親本具有的顏色〕交融子檢出戰(zhàn)略菌株A菌株B

液體培育液體培育

搜集菌體搜集菌體

洗滌菌體洗滌菌體

酶解釋放原生質(zhì)體酶解釋放原生質(zhì)體

分別純化原生質(zhì)體分別純化原生質(zhì)體

AB原生質(zhì)體等量混合

原生質(zhì)體交融原生質(zhì)體交融操作程序?qū)μ暨x出的交融子必需進(jìn)展鑒定，以確定其交融子特性。

①細(xì)胞構(gòu)造程度核相單核→雙核特殊構(gòu)造構(gòu)成

PCR

②遺傳本質(zhì)特定基因序列的檢出

RAPD

③生長(zhǎng)發(fā)育特性個(gè)體形狀特性

④目的構(gòu)造的檢出交融子的鑒定遠(yuǎn)緣親本原生質(zhì)體交融構(gòu)成的雜和體在遺傳體系上存在差別，兩套基因組能否協(xié)同作用，會(huì)導(dǎo)致基因組穩(wěn)定性問(wèn)題，兩套基因組的共同表達(dá)，選擇表達(dá)也是有待繼續(xù)研討的問(wèn)題。遠(yuǎn)緣親本原生質(zhì)體交融①影響原生質(zhì)體本身活性的要素

②原生質(zhì)體制備形狀保管條件

③再生時(shí)的培育條件與操作方法影響原生質(zhì)體再生的因子1.菌體的生長(zhǎng)時(shí)期菌體旺盛生長(zhǎng)期長(zhǎng)為好對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2．體預(yù)處置在北京棒壯桿菌處置時(shí)參與胺卞青霉素有利與原生質(zhì)體釋放，巴氏梭狀芽孢桿菌培育時(shí)加1.5％乳糖可提高再生率

3．酶解條件浸透壓穩(wěn)定劑Ca+、Mg+蔗糖可堅(jiān)持原生質(zhì)體穩(wěn)定利于再生

酶解時(shí)間隨著酶解時(shí)間的添加原生質(zhì)體的釋放量增大

酶解濃度到達(dá)一定濃度后原生質(zhì)體的再生率下降

酶解溫度菌體生長(zhǎng)溫度影響原生質(zhì)體活性的要素較低溫度可以有效的堅(jiān)持原生質(zhì)體的活性

細(xì)菌4℃48小時(shí)

放線菌4℃24小時(shí)

真菌0~4℃保管2天原生質(zhì)體儲(chǔ)存條件細(xì)菌易再生可達(dá)90％甚至100％有些種類也很低，

小單孢菌只需10-3

放線菌可達(dá)50％

絲狀真菌“產(chǎn)黃青霉〞40~60％影響原生質(zhì)體存活的遺傳要素1．再生培育基應(yīng)具備維系、維護(hù)又支持和營(yíng)養(yǎng)的功能

2．再生培育溫度

3．操作方式涂布培育法涂布時(shí)對(duì)原生質(zhì)體有損壞

4．固體培育普通以為固體培育優(yōu)于液體培育

原生質(zhì)體再生培育條件再生培育基應(yīng)具備維系、維護(hù)又支持和營(yíng)養(yǎng)的功能

①用MgSO4、甘露醇、山梨糖、蔗糖為浸透劑，不同的微生物種類應(yīng)選擇不同的再生培育基。

②營(yíng)養(yǎng)因子，酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖類

③原生質(zhì)體維護(hù)劑擴(kuò)張劑的作用

牛血潔白蛋白、人血潔白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮〔PVP〕明膠等對(duì)原生質(zhì)體具有維護(hù)作用，同時(shí)起到原生質(zhì)體擴(kuò)張劑作用，刺激原生質(zhì)體再生

④參與再生細(xì)胞壁誘導(dǎo)物與前體物質(zhì)

在培育基中加明膠、細(xì)胞壁殘片甚至纖維素濾膜都有刺激原生質(zhì)體再生的功能原生質(zhì)體過(guò)高溫度對(duì)原生質(zhì)體再生有抑制造用，當(dāng)再生溫度略低于菌株培育溫度時(shí)，有利于原生質(zhì)體的再生再生培育溫度涂布培育法涂布時(shí)對(duì)原生質(zhì)體有損壞

雙層培育法將原生質(zhì)體包埋于半固體瓊脂中有利與再生

操作方式固體培育普通以為固體培育優(yōu)于液體培育

液體培育時(shí)細(xì)胞壁可溶性物質(zhì)很容易分散〔如酵母在液體再生液中很難再生〕固體培育基限制有效分子的分散，但先在液體培育基中預(yù)培育2~3小時(shí)有利于提高再生率培育方法對(duì)原生質(zhì)體再生的影響1．多細(xì)胞菌體的單細(xì)胞化作用

2．真菌雙核體單核化作用

3．菌體脫壁再生優(yōu)良菌株原生質(zhì)體

4．原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)的其他用途1．多細(xì)胞菌體的單細(xì)胞化作用

許多真菌營(yíng)養(yǎng)體是多細(xì)胞的，當(dāng)進(jìn)展誘變處置時(shí)，首先應(yīng)進(jìn)展單細(xì)胞化，采用脫壁構(gòu)成的原生質(zhì)體，可以用于誘變處置

2．真菌雙核體單核化作用

許多高等單子菌的次生菌絲是雙核體原生質(zhì)體釋放再生過(guò)程可以單細(xì)胞化，為快速挑選單核體用于育種以及從野生菌人工栽培難以構(gòu)成子實(shí)體制備單核體提供方法原生質(zhì)的單細(xì)胞化作用原生質(zhì)體具有異質(zhì)性，脫壁再