多酸基熒光檢測(cè)微球的制備及布魯氏菌檢測(cè)方法的研究

多酸基熒光檢測(cè)微球的制備及布魯氏菌檢測(cè)方法的研究近年來(lái)，全球范圍內(nèi)新發(fā)公共傳染病不斷發(fā)生，其病原體75%源自動(dòng)物或動(dòng)物源性食品。新發(fā)公共傳染病已越來(lái)越多的呈現(xiàn)出“人禽共患”或“人畜共患”的特點(diǎn)。其中由布魯氏菌引起的傳染病在我國(guó)尤其是在牧區(qū)發(fā)病率較高，且傳染性較強(qiáng)。布魯氏菌病的高發(fā)和流行不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅人群的健康。對(duì)布魯氏菌病的預(yù)防、監(jiān)督檢查現(xiàn)已引起世界各國(guó)的廣泛重視，加強(qiáng)對(duì)布魯氏菌的預(yù)防和監(jiān)控現(xiàn)已納入世界衛(wèi)生組織和我國(guó)衛(wèi)生部傳染病檢測(cè)的主要工作內(nèi)容之一。因此，開發(fā)快速、高效、特異的布魯氏菌病檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)已成為公共衛(wèi)生檢測(cè)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)課題之一。本課題研究主要是設(shè)計(jì)合成了多酸基熒光免疫探針，利用雙抗體夾心熒光免疫原理，借助液相芯片檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，建立一種安全、準(zhǔn)確、特異的布魯氏菌檢測(cè)方法。本課題研究分為四個(gè)部分：第一部分布魯氏菌多克隆抗體與單克隆抗體的制備及鑒定。①多克隆抗體的制備及鑒定：利用羊種布魯氏菌M5疫苗皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭白兔，每次免疫前耳緣靜脈取血，測(cè)定其血清效價(jià)，達(dá)到所需標(biāo)準(zhǔn)，兔心臟采血并分離血清，用硫酸銨沉淀法結(jié)合ProteinG親和層析法進(jìn)行抗體純化，Bradford法測(cè)定抗體蛋白含量，間接ELISA、SDS凝膠電泳試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)和純度，并利用生物素進(jìn)行標(biāo)記。結(jié)果顯示純化后布魯氏菌多抗純度較高，蛋白含量為8.22mg·L^-1，效價(jià)可達(dá)到1:64000，每摩爾多克隆抗體蛋白可標(biāo)記生物素摩爾數(shù)為2.61。②單克隆抗體的制備及鑒定：采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，以羊種布魯氏菌M5為抗原免疫BALB/c小鼠，在細(xì)胞融合前4d加強(qiáng)免疫。取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。用已建立的間接ELISA進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性篩選，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，篩選出能穩(wěn)定分泌M5抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，小鼠體內(nèi)誘生法制備單抗腹水，并對(duì)腹水中的單抗用硫酸銨沉淀法結(jié)合ProteinG親和層析法進(jìn)行純化，Bradford法測(cè)定蛋白含量，間接ELISA、SDS凝膠電泳試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)和純度。結(jié)果顯示經(jīng)過亞克隆篩選出1株能穩(wěn)定分泌M5單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，抗體亞型為IgG₃型，純化濃縮后的抗體蛋白含量為4.39mg·L^-1，效價(jià)可達(dá)到1:6400，純度較高，特異性較好。第二部分多酸基熒光發(fā)光材料的合成與表征。①采用有機(jī)無(wú)機(jī)雜化法，設(shè)計(jì)合成新型多酸熒光N（C₄H₉）₄]₂[V₆O₁₃{（OCH₂）₃CNH-CH₂-C₁₆H₉}₂化合物。利用X-射線單晶衍射、氫核磁、碳核磁、紅外光譜、紫外光譜和熒光光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行表征。結(jié)果顯示該化合物呈負(fù)電性，紅外光譜特征峰為2958、2929、2870、1482、1378、811、795、718cm^-1，紫外特征吸收峰為244、270、283、389、345nm，激發(fā)峰為262、275、329、345nm，在345nm激發(fā)下的發(fā)射波譜范圍較寬，最高發(fā)射峰在400nm處。②采用常規(guī)的多酸化學(xué)合成方法，合成Na₉EuW₁₀O₃₆，利用紅外光譜、紫外光譜和熒光光譜對(duì)所合成的化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，該化合物紅外光譜特征峰為543、705、785、843、945nm，紫外特征吸收峰為208和258nm，在278nm激發(fā)下的發(fā)射峰位于579、592、619、651、692、700nm。第三部分功能化多酸基熒光檢測(cè)微球的制備與表征。①功能化多酸熒光染料[N（C₄H₉）₄]₂[V₆O₁₃{（OCH₂）₃CNH-CH₂-C₁₆H₉}₂]標(biāo)記聚苯乙烯微球的制備與表征：采用分散聚合法合成聚苯乙烯微球，微球粒徑約為2.8μm，選用聚電解質(zhì)PDADMAC、PAA、PAH對(duì)微球進(jìn)行活化，采用層接層靜電自組裝法將所制備的多酸熒光染料[N（C₄H₉）₄]₂[V₆O₁₃{（OCH₂）₃CNH-CH₂-C₁₆H₉}₂]包覆在微球表面，通過聚電解質(zhì)進(jìn)一步修飾，使微球表面帶有羧基官能團(tuán)。利用Zeta電位、熒光光譜和激光共聚焦顯微鏡對(duì)所制備的微球進(jìn)行表征，結(jié)果顯示多酸熒光染料和聚苯乙烯微球可以較好的偶聯(lián)，且具有良好的熒光發(fā)光特性。②功能化多酸熒光染料[N（C₄H₉）₄]₂[V₆O₁₃{（OCH₂）₃CNH-CH₂-C₁₆H₉}₂]標(biāo)記二氧化硅微球的制備與表征：采用種子聚合法合成二氧化硅微球，微球粒徑約為1μm，選用聚電解質(zhì)PEI和PAA對(duì)微球進(jìn)行活化，采用層接層靜電自組裝法將所制備的多酸熒光染料[N（C₄H₉）₄]₂[V₆O₁₃{（OCH₂）₃CNH-CH₂-C₁₆H₉}₂]包覆在微球表面，通過聚電解質(zhì)進(jìn)一步修飾，使微球表面帶有羧基官能團(tuán)。利用Zeta電位、熒光光譜和流式細(xì)胞儀對(duì)所制備的微球進(jìn)行表征。結(jié)果顯示多酸熒光染料和二氧化硅微球可以較好的偶聯(lián)，且具有良好的熒光發(fā)光特性。③功能化多酸熒光染料Na₉EuW₁₀O₃₆標(biāo)記聚苯乙烯微球的制備與表征：采用細(xì)乳液聚合法將Na₉EuW₁₀O₃₆雜化引入聚苯乙烯微球中，通過聚電解質(zhì)進(jìn)一步修飾，使微球表面帶有羧基官能團(tuán)。利用紫外光譜、熒光光譜、Zeta電位和透射電鏡對(duì)所制備的微球進(jìn)行表征。結(jié)果顯示Na₉EuW₁₀O₃₆與聚苯乙烯微球可以較好的雜化，且具有良好的熒光發(fā)光特性。第四部分布魯氏菌液相芯片檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)。①布魯氏菌液相芯片檢測(cè)方法的建立：利用雙抗體夾心熒光免疫分析原理，采用液相芯片檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，通過對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立一種布魯氏菌液相芯片檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的檢測(cè)效果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，本課題所建立的檢測(cè)方法最佳反應(yīng)條件為：?jiǎn)慰棺罴雅悸?lián)濃度8.3125μg·mL^-1，生物素標(biāo)記的多克隆抗體工作濃度為432μg·mL^-1，SA-PE的工作濃度為8μg·mL^-1。該方法檢測(cè)的特異性和重復(fù)性較好，利用該方法檢測(cè)羊布魯氏菌M5最低檢出限為1.0×10<sup>6</sup