丙泊酚對卵巢癌細(xì)胞侵襲和紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用中轉(zhuǎn)錄因子Slug的影響

丙泊酚對卵巢癌細(xì)胞侵襲和紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用中轉(zhuǎn)錄因子Slug的影響背景和目的卵巢癌(OVCA)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。由于卵巢在盆腔內(nèi)位置較深,卵巢癌早期又缺乏特異性癥狀,卵巢癌已是女性死于癌癥相關(guān)疾病的第五大原因,是幾十年困擾臨床醫(yī)生和研究者的難題。這主要是由于缺少疾病的早期檢測方法,導(dǎo)致原發(fā)腫瘤快速地具有侵略性地細(xì)胞腹膜擴(kuò)散,致使大多數(shù)患者的不良預(yù)后。獲得遷移和侵襲能力是公認(rèn)的卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的一個必要的先決條件,但導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)理尚未得到很好的闡明?；熕幬锬退幮允悄[瘤治療中一個嚴(yán)峻的問題,因為許多腫瘤對使用的一些細(xì)胞毒試劑本質(zhì)上是耐受的,而其余腫瘤,盡管它們最初是敏感的,在重復(fù)使用抗腫瘤試劑后,最終對抗腫瘤試劑產(chǎn)生耐受性。對卵巢癌,在腫瘤的最佳切除手術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化療后,晚期疾病患者增加5年生存率。盡管卵巢癌對化學(xué)治療相對敏感,但臨床上化學(xué)治療經(jīng)常遭遇耐藥性。這種獲得性耐藥性的發(fā)展成為成功治療的主要限制。因此,迫切需要確定腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐藥機(jī)制以研制新的藥物重新提高腫瘤細(xì)胞對主要化療的靈敏度。近期對食管鱗狀細(xì)胞癌,膀胱癌,胰腺癌和卵巢癌的研究表明,轉(zhuǎn)錄因子Slug是侵襲過程和致癌過程中的重要操縱子。在膽管癌細(xì)胞中,Slug沉默能夠增強(qiáng)細(xì)胞對順鉑和輻射的敏感性。在卵巢癌中,Slug也能調(diào)控抗輻射和藥物抗性。因此,我們認(rèn)為Slug可能是一個有效的基因靶。丙泊酚(2,6一二異丙基苯酚),是一種能夠產(chǎn)生平穩(wěn)誘導(dǎo)且能迅速蘇醒的最常用的靜脈麻醉藥,自上世紀(jì)八十年代末引進(jìn)國內(nèi),現(xiàn)已廣為接受。除了具有多種麻醉優(yōu)越性,丙泊酚還能發(fā)揮一些非麻醉劑的作用。丙泊酚可通過調(diào)節(jié)RhoA抑制癌細(xì)胞的侵襲能力,暗示它可能是癌癥手術(shù)中完美的麻醉劑。在肺癌細(xì)胞中,體外實驗證明丙泊酚可阻止MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白的表達(dá),從而抑制侵襲和遷移。在結(jié)腸癌細(xì)胞中,丙泊酚促進(jìn)抑制癌細(xì)胞的侵襲部分是由于ERK1/2-依賴的金屬蛋白酶減量調(diào)節(jié)。我們最近報道了丙泊酚使NF-κB信號通路失活可以廢除吉西他濱誘導(dǎo)的NF-κB活性活化,結(jié)果導(dǎo)致了胰腺腫瘤的化療增敏作用。然而,在膽囊癌中,丙泊酚卻通過活化Nrf2誘導(dǎo)增殖和促進(jìn)入侵。在本研究中,我們用對紫杉醇敏感的和耐藥的卵巢癌細(xì)胞株在體外檢測了丙泊酚對細(xì)胞侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響,同時觀測slug水平與之相關(guān)性。以期探明丙泊酚是否對卵巢癌細(xì)胞侵襲具有抑制作用；是否能夠促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡；轉(zhuǎn)錄因子Slug是否是丙泊酚抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲并促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡的一個有效的基因靶。材料和方法1.細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM,HO-8910,SKOV-3,OVCAR-3,COC1和ES-2。SKOV-3和OVCAR-3細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中,加10%熱滅活胎牛血清,50μg/mL慶大霉素和1mmol/L丙酮酸鈉。HO-8910PM,HO-8910,COC1和ES-2培養(yǎng)在RPMI培養(yǎng)基中,加10%胎牛血清,1%青霉素/鏈霉素和1%L-谷氨酰胺。所有的細(xì)胞都是在37℃含有5%的CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。2.藥物暴露將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板,5×103個細(xì)胞/孔。孵育24小時后,用含有一系列濃度紫杉醇(0.01-10μmol/L)或丙泊酚(0.1-10μg/mL)的含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)72小時做劑量依賴分析。時間依賴的測定,5×103個細(xì)胞/孔在含10μmol/L紫杉醇或5μg/mL丙泊酚的5%胎牛血清MEM培養(yǎng)基中孵育24-72h。采用MTT法測定剩余活細(xì)胞的相對數(shù)。TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡3.化學(xué)敏感性試驗細(xì)胞接種于96孔板,5×103個細(xì)胞/孔。孵育24小時后,培養(yǎng)基替換為含5μg/ml丙泊酚的5%胎牛血清MEM,額外孵育24小時,將細(xì)胞暴露于0.1μmol/L的紫杉醇溶液48小時。剩余活細(xì)胞的相對數(shù)量采用MTT法測定。TUNEL染色法檢測凋亡細(xì)胞。4.MTT實驗5×103個細(xì)胞/孔種板,每組設(shè)置3個重復(fù)孔,按上述方法作用標(biāo)示時間后,每孔添加10μLMTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-二苯基溴化物),避光培養(yǎng)4小時。吸出培養(yǎng)基MTT混合物,每孔添加150μLMTT溶劑(0.1N鹽酸無水異丙醇)。室溫?fù)u床孵育10分鐘,用移液管充分混合直到所有的甲晶體溶解。以690nm處的吸光度為背景測量570nm的吸光度變化。從570nm的吸收值減去690nm的吸收值以獲得最終的吸收值。5.TUNEL實驗上述細(xì)胞1×104個,在指定的時間移至玻片培養(yǎng)24小時。細(xì)胞凋亡根據(jù)制造商的說明用TUNEL法評價。所有試驗均一式四份。6.細(xì)胞侵襲實驗侵襲實驗,HO-8910PM,HO-8910,SKOV-3,OVCAR-3,COC1和ES-2細(xì)胞,用0.1-10微克/毫升丙泊酚處理72小時,或5微克/毫升的丙泊酚處理24-72小時。然后2×103個上述細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中添加到每個插條的內(nèi)部。板在5%的二氧化碳中37℃孵育24小時后,將插條中的介質(zhì)移除,并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗插條。插條膜用冷甲醇固定10分鐘,在25%甲醇中用0.5%結(jié)晶紫染色10分鐘,水沖洗除去多余的染料。將膜從插條內(nèi)移出,放在顯微鏡下,清點(diǎn)遷移通過多孔膜的細(xì)胞數(shù)量。7.蛋白質(zhì)印跡分析蛋白質(zhì)印跡分析,用冰冷的磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞二次,并在細(xì)胞裂解液中裂解30分鐘。樣品超聲處理30秒,離心力12000×g,4℃離心20min。樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后在硝酸纖維素膜上電泳印跡。膜被阻擋在含5%牛奶的TBS/吐溫-20緩沖液,并和稀釋在TBS/吐溫-20/BSA(牛血清白蛋白)中的初次抗體在4℃下孵育一夜。隨后的要素是抗-slug。所有印跡與結(jié)合辣根過氧化物酶(HRP)(2000/1)的二抗一起孵育,使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法(ECL)培養(yǎng)。采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。8.統(tǒng)計分析統(tǒng)計上的顯著差異由配對t檢驗和單因素方差分析檢測,定義P<0.05。所有實驗均獨(dú)立地重復(fù)至少三次。結(jié)果1.卵巢癌(OC)細(xì)胞系對紫杉醇耐藥性的變化我們體外研究了六個卵巢癌細(xì)胞系(HO-8910PM,HO-8910,SKOV-3,OVCAR-3,COC1和ES-2)對紫杉醇的相對靈敏度。卵巢癌細(xì)胞用不同濃度的紫杉醇處理72小時,存活細(xì)胞數(shù)用MTT法分析。由此,對HO-8910PM,OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞,紫杉醇的LD50>10微摩爾/升,HO-8910,COC1和ES-2細(xì)胞的LD50為0.1微摩爾/升左右。當(dāng)用TUNEL法分析紫杉醇對細(xì)胞凋亡的影響時獲得同樣敏感性。這些數(shù)據(jù)支持將HO-8910PM,OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞株對紫杉醇耐藥,HO-8910,COC1和ES-2細(xì)胞株對紫杉醇敏感的分類。2.卵巢癌細(xì)胞系的slug水平為了檢驗slug基底水平可以預(yù)測紫杉醇的敏感性這一假設(shè),我們最初通過蛋白質(zhì)印跡試驗評估卵巢癌細(xì)胞系slug水平。Slug蛋白含量最高的是HO-8910PM,OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞,slug蛋白水平最低的是HO-8910,COC1和ES-2細(xì)胞。因此,卵巢癌細(xì)胞表現(xiàn)出升高的slug,耐藥細(xì)胞對敏感性細(xì)胞株有一致的slug模式,紫杉醇敏感細(xì)胞對紫杉醇耐藥細(xì)胞slug有一致的差異。3.紫杉醇治療增加敏感細(xì)胞中slug的表達(dá)但對耐藥細(xì)胞無作用HO-8910PM,HO-8910,SKOV-3,OVCAR-3,COC1和ES-2細(xì)胞分別以0.001,0.01,0.1,1,10微摩爾/升紫杉醇處理24小時,用蛋白質(zhì)印跡法檢測slug。用0.001-10微摩爾/升紫杉醇處理24小時對耐藥的HO-8910PM,OVCAR-3,SKOV-3細(xì)胞中slug水平無顯者影啊。然而,對紫杉醇敏感的HO-8910,COC1和ES-2細(xì)胞,用0.1微摩爾/升的紫杉醇處理24小時slug的水平顯著增加。4.丙泊酚治療可抑制耐藥細(xì)胞的細(xì)胞侵襲但不作用于敏感細(xì)胞全身麻醉丙泊酚血漿靶濃度在3至8μg/mL之間。在本研究中,卵巢癌HO-8910PM,HO-8910,SKOV-3,OVCAR-3,COC1和ES-2細(xì)胞用0.1-10μg/mL丙泊酚處理72小時,或5μg/mL的丙泊酚處理24-72小時。抑制入侵的劑量依賴方式和時間依賴方式-在紫杉醇耐藥的卵巢癌HO-8910PM,OVCAR-3,SKOV-3細(xì)胞,5-10μg/mL丙泊酚的濃度足以抑制癌細(xì)胞的侵襲能力。而在紫杉醇敏感細(xì)胞HO-8910,COC1和ES-2中丙泊酚的抑制效應(yīng)不明顯。5.丙泊酚治療可抑制耐藥細(xì)胞的細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡但對敏感細(xì)胞不起作用HO-8910PM,HO-8910,SKOV-3,OVCAR-3,COC1和ES-2細(xì)胞經(jīng)0.1-10μg/mL丙泊酚處理24、48和72小時。丙泊酚降低紫杉醇耐藥細(xì)胞HO-8910PM,OVCAR-3,SKOV-3的增殖,MTT法檢測其具有時間依賴和劑量依賴行為。用TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析,丙泊酚促進(jìn)紫杉醇耐藥細(xì)胞HO-8910PM,OVCAR-3和SKOV-3的凋亡。在紫杉醇敏感的HO-8910,COC1和ES-2細(xì)胞中無顯著效果。6.紫杉醇治療后丙泊酚對耐藥性和敏感性細(xì)胞中的slug均能抑制因為5μg/mL丙泊酚處理48小時后能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。因此,我們用5μg/mL丙泊酚處理48小時做進(jìn)一步的研究。HO-8910PM,HO-8910,SKOV-3,OVCAR-3,COC1和ES-2細(xì)胞經(jīng)5μg/mL丙泊酚處理48小時。細(xì)胞中Slug蛋白顯著地或完全地被抑制。雖然0.1μmol/L紫杉醇治療24小時后顯著增加了對紫杉醇敏感的HO-8910,COC1口ES-2細(xì)胞的slug水平,5μg/mL丙泊酚預(yù)處理則完全抑制0.1μmol/L紫杉醇治療48小時后Slug蛋白。7.丙泊酚增強(qiáng)紫杉醇對耐藥和敏感細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡丙泊酚治療會增加卵巢癌細(xì)胞系對紫杉醇促成的細(xì)胞凋亡的敏感性,為了檢驗這一假設(shè),卵巢癌HO-8910PM,HO-8910,SKOV-3,OVCAR-3,COC1和ES-2細(xì)胞用5μg/mL丙泊酚預(yù)處理24小時,然后檢測其單獨(dú)作用及其和0.1μmol/L濃度的紫杉醇的聯(lián)合作用。丙泊酚聯(lián)合0.1μ