發(fā)酵產物的提取與精制概論

第十章發(fā)酵產物的提取與精制概論第一節(jié)發(fā)酵產物的提取與精制概述一、發(fā)酵產物的分類1、菌體2、酶3、代謝產物二、下游加工過程的特點1、發(fā)酵液是復雜的多相系統(tǒng)，成分復雜：細胞、代謝產物、殘余培養(yǎng)基2、產品濃度低：傳統(tǒng)發(fā)酵一般1～10％3、普遍存在下游工程代價高，回收率較低（50％）左右等問題4、產品存在失活、不穩(wěn)定性問題5、生物安全問題三、下游加工過程設計應遵循的基本原則1、時間短2、溫度低3、pH適中4、清潔衛(wèi)生四、發(fā)酵產物提取與精制的過程1、對未知的發(fā)酵產品提取的步驟（1）確定發(fā)酵產物的類型（2）確定發(fā)酵產物的穩(wěn)定性2、發(fā)酵產物提取和精制過程的一般程序成品加工發(fā)酵液的預處理提取精制采用凝聚和絮凝技術加速固、液分離；如產物在細胞內，還要進行細胞破碎提?。ǔ醪郊兓┠康氖浅ヅc目標產物性質差異大的雜質精制（高度純化）是采用對產品有高度選擇性的分離技術，除去與產物化學性質和物理性質相近的雜質最終獲得質量合格的產品包括的階段

（1）發(fā)酵液的預處理離心和過濾（2）產品的提取萃取、吸附、沉淀、蒸發(fā)（3）產品的精制層析、膜分離、離子交換、沉淀、電泳（4）產品的最后加工結晶、干燥、蒸餾第二節(jié)發(fā)酵醪的預處理

一、發(fā)酵醪的一般特征1、含水量高，一般可達90％～99%2、產品濃度低3、懸浮物顆粒小，密度與液體相差不大4、固體粒子可壓縮性大5、液體黏度大，大多為非牛頓型流體6、產物性質不穩(wěn)定二、發(fā)酵醪預處理的目的和要求1、預處理的目的：

改變發(fā)酵液的物理性質，加快懸浮液中固形物沉降的速度；盡可能使產物轉入便于以后處理的相中；能夠除去部分雜質。2、發(fā)酵醪預處理的要求:（1）菌體的分離（2）固體懸浮物的去除（3）蛋白質的去除（4）重金屬離子的去除（5）色素、熱原質、毒性物質等有機雜質的去除（6）改變發(fā)酵醪的性質（7）調節(jié)適宜pH值和溫度三、預處理的方法：1、加熱法：降低懸浮液的黏度，除去某些雜蛋白，降低懸浮物的最終體積，破壞凝膠狀結構、增加濾餅的空隙度不適用熱敏性的物質2、調節(jié)懸浮液的pH

通過調節(jié)發(fā)酵醪pH到蛋白質的等電點使蛋白質沉淀，同時絡合重金屬離子；常用的酸化劑有草酸、鹽酸、硫酸和磷酸3、凝聚和絮凝

凝聚：在投加的化學物質（比如水解的凝聚劑，像鋁、鐵的鹽類或石灰等）作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚成1mm大小塊狀凝聚體的過程。

凝聚劑的作用：有些是對初始粒子表面電荷的簡單中和，另一些是消除雙電荷層（采用中性鹽例如NaCl等）而脫穩(wěn)，還有些是通過氫鍵或其他復雜的形式與粒子相結合而產生凝聚。絮凝：使用絮凝劑（通常是天然或合成的大分子量聚電解質）將膠體粒子交聯成網，形成10mm大小絮凝團的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用。凝聚劑和絮凝劑的種類：（1）凝聚劑：主要是無機類電解質，大多為陽粒子無機鹽類：硫酸鋁、明礬、硫酸鐵、硫酸亞鐵、三氯化鐵、氯化鋁、硫酸鋅、硫酸鎂、鋁酸鈉金屬氧化物類：氫氧化鋁、氫氧化鐵、氫氧化鈣、石灰聚合無機鹽類：聚合鋁、聚合鐵（2）絮凝劑（按官能團分）陰離子、陽離子、非離子丙烯酰胺經不同的改性可成為上述三種類型之一絮凝劑比凝聚劑貴絮凝劑的最佳使用劑量：粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋時所用的絮凝劑量。4、添加助濾劑：

一般為惰性助濾劑：是一種顆粒均勻、質地堅硬、不可壓縮的粒狀物質

作用：助濾劑表面具有吸附膠體的能力，并且由此助濾劑顆粒形成的濾餅具有格子型結構，不可壓縮，濾孔不會被全部堵塞，可以保持良好的滲透性

使用方法（1）在濾布上預涂，作為過濾介質使用

（2）按一定比例混入待濾的懸浮液中常用的助濾劑：硅藻土、膨脹珍珠巖、石棉、纖維素、未活化的碳、爐渣、重質碳酸鈣

助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，從而增加濾速；

常用硅藻土、珍珠巖等；

加入方法有兩種：a)預先在濾布上鋪上一層1-2mm厚的助濾劑；b)直接把助濾劑加入發(fā)酵液中。5、添加反應劑：添加可溶解的鹽類，生成不溶解的沉淀；生成的沉淀能防止菌絲體粘結，使菌絲具有塊狀結構；沉淀本身可作為助濾劑，還能使膠狀物和懸浮物凝固。

6、添加酶制劑：

比如：加酶將多糖轉化為單糖四、菌體的分離方法（1）離心分離管式高速離心機、碟片式離心機（2）過濾真空過濾機、板框過濾機、常用過濾設備1）板框(plateandframe)壓濾機板框過濾機結構圖

（曹軍衛(wèi)320頁）1-尾板2-濾框3-濾板4-主梁5-頭板6-緊壓裝置2）帶式壓濾機

發(fā)酵后期要少加消泡劑和少進行補料，防止消泡劑和未用完的培養(yǎng)基增加過濾難度；

菌體自溶前放罐可防止因菌體自溶釋放出的代謝產物增加發(fā)酵液黏度3、影響發(fā)酵液過濾的因素1）菌體細胞體積

真菌菌絲體較粗大，質量比阻小，發(fā)酵液不需經特殊處理就很容易過濾；

放線菌菌絲細而分支，交織成網格狀，質量比阻力大，較難過濾，發(fā)酵液需經預處理，凝固蛋白質等膠體物質，提高過濾速度；

細菌菌體更小，發(fā)酵液如不經絮凝等預處理，很難用常規(guī)過濾設備進行過濾操作。2）培養(yǎng)基組成黃豆餅粉、花生餅粉等會增加過濾難度3）放罐時機五、細胞破碎細胞破碎的意義微生物代謝產物大多數分泌到胞外，但有些目標產物存在細胞內部。目前重組DNA技術，表達的產品（如胰島素、干擾素、白細胞介素等），都是胞內產物。首先必須將細胞破碎，使產物得以釋放，才能進一步提取。常用破碎方法

機械法：珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破碎法、X-press法等非機械法：酶溶法、化學滲透法、凍融法、干燥法等1、機械破碎法特點：處理量大、破碎效率高、速度快；原理：對物料的擠壓和剪切作用；主要方法：

高壓勻漿珠磨超聲波破碎高壓勻漿（1）原理：細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的間隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊后，急速釋放到低壓環(huán)境，在撞擊力與剪切力的綜合作用下破碎。（2）影響破碎率的因素：細胞壁、壓力、溫度、通過勻漿器的次數

不適合絲狀真菌及包含體的基因工程菌

珠磨

工作原理：進入珠磨機的細胞懸浮液與極小的研磨劑，即微球（玻璃小珠、石英砂、氧化鋁d<1mm）一起快速攪拌，細胞與微球之間互相碰撞、剪切，使細胞破碎，釋放內含物。

珠磨

特點：微球粒徑與目標細胞的直徑比應在30-100之間，適宜的微球粒徑，可以使破碎效率最高；破碎過程產生熱能，要注意熱交換；適用于絕大多數微生物細胞的破碎；珠磨法的破碎率一般控制在80%。超聲波破碎1、工作原理在超聲波的作用下，液體發(fā)生空化作用，空穴的形成，增大和閉合產生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎2、影響因素：聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度、菌種類型超聲波破碎

3、特點：1）適應于實驗室規(guī)模的應用（操作簡單、液量損失少，可加冰或加冷水，大規(guī)模操作時，聲能傳遞和散熱困難）2）易失活物質不宜用（超聲波可促使產生一些化學自由基因使物失活）3）G-桿菌破碎效果好，酵母菌效果差2、非機械法（1）酶溶法：（2）化學法利用化學試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分的方法①酸堿來調節(jié)溶液的pH②有機溶劑：甲苯③表面