蠶絲蛋白調(diào)控?zé)o機納米粒子自組裝體及其抗腫瘤性能研究

蠶絲蛋白調(diào)控?zé)o機納米粒子自組裝體及其抗腫瘤性能研究無機納米粒子由于其特殊的物理性質(zhì)與化學(xué)性質(zhì)在癌癥治療領(lǐng)域得到了廣泛的研究。自組裝是一種簡單的調(diào)控方式,通過模板改變納米粒子的形狀或排列優(yōu)化其應(yīng)用性能。家蠶絲蛋白具有良好的生物安全性與自組裝特性,本研究以家蠶絲蛋白(絲素和絲膠)為生物模板調(diào)控?zé)o機納米粒子的自組裝。本論文以二氧化硅納米粒子(SiO2)與金納米粒子(AuNPs)為研究對象,探索絲蛋白調(diào)控二氧化硅與金納米粒子自組裝形成納米球或納米纖維的最佳條件,并對其調(diào)控機理進行探討。在此基礎(chǔ)上,檢驗二氧化硅/絲蛋白復(fù)合納米材料藥物載體的功效,金/絲蛋白復(fù)合納米材料的光熱效應(yīng),通過細胞培養(yǎng)與動物體內(nèi)實驗,證明絲蛋白/納米粒子自組體能有效抑制腫瘤生長。本論文研究工作主要包括以下4部分:(1)蠶絲蛋白調(diào)控二氧化硅納米粒子自組裝構(gòu)建復(fù)合納米粒子首先采用蠶絲纖維(脫膠絲素纖維和電紡絲素納米纖維)為模板進行二氧化硅納米粒子自組裝調(diào)控的嘗試。結(jié)果表明,蠶絲纖維能夠誘導(dǎo)硅納米粒子生成二氧化硅微管。絲素纖維制備的微管孔徑大、不穩(wěn)定,而絲素納米纖維為模板制備的二氧化硅微管孔徑約500nm,表面光滑,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在此基礎(chǔ)上,采用絲素蛋白(SF)與絲膠蛋白(SS)為軟模板,調(diào)控二氧化硅納米粒子的成核與自組裝。結(jié)果表明濃度范圍在0.1mg/mL至10mg/mL的絲素蛋白能夠調(diào)控二氧化硅自組裝成納米球,而濃度范圍在0.01mg/mL至1mg/mL的絲膠蛋白能夠調(diào)控二氧化硅自組裝成納米纖維。而且,改變氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和硅酸四乙酯(TEOS)的濃度,皆可調(diào)控二氧化硅納米球與二氧化硅納米纖維自組體的尺寸與形貌。形成二氧化硅納米自組體的同時,其二級結(jié)構(gòu)與表面電位均發(fā)生了變化,表明絲蛋白是通過氫鍵和靜電引力的作用實現(xiàn)了對二氧化硅納米粒子自組裝。(2)二氧化硅/絲蛋白復(fù)合納米粒子用于抗腫瘤藥物載體將二氧化硅/絲素納米球(Si/SF)與二氧化硅/絲膠納米纖維(Si/SS)作為藥物載體,對抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)進行裝載,并研究藥物在載體中的釋放行為。結(jié)果表明,二氧化硅/絲蛋白復(fù)合納米粒子具有很高的藥物裝載能力,對DOX的裝載率達到30%,對PTX的裝載率也接近10%;體外釋放結(jié)果表明,DOX能在二氧化硅/絲蛋白復(fù)合納米粒子中持續(xù)釋放并具有pH響應(yīng)性。Si/SF納米球與Si/SS納米纖維分別與HeLa細胞進行共培養(yǎng)12h和24h,通過胞內(nèi)定位與細胞毒性發(fā)現(xiàn),Si/SF納米球能進入HeLa細胞,而Si/SS納米纖維則粘附在細胞表面,對HeLa細胞半致死抑制濃度(IC50)>1mg/mL,說明納米球與納米纖維形狀載體具有生物安全性。將DOX裝載到二氧化硅/絲蛋白復(fù)合納米粒子與HeLa細胞共培養(yǎng)1,2,3和5d,對細胞活力進行比較分析。結(jié)果顯示,DOX經(jīng)過Si/SF納米球和Si/SS納米纖維的裝載,能夠快速到達腫瘤細胞,更早發(fā)揮作用,抑制腫瘤細胞的生長。因此,與單純DOX相比,裝載DOX的二氧化硅/絲蛋白復(fù)合納米粒子能夠更有效的殺死腫瘤細胞。(3)蠶絲蛋白調(diào)控金納米粒子自組裝成納米纖維。采用溶膠法制備并用聚乙烯亞胺(PEI)修飾合成表面帶正電荷的金納米粒子。將絲素蛋白與金納米粒子反應(yīng),調(diào)控金納米粒子的自組裝。結(jié)果表明,絲素蛋白濃度范圍在25μg/mL至200μg/mL的情況下,可調(diào)控金納米粒子成纖維狀排列,并且改變絲素濃度、調(diào)控時間及PEI的分子量與濃度,可調(diào)控金納米粒子形成不同的自組裝形貌。電勢分析與結(jié)構(gòu)測試表明絲蛋白利用靜電引力對金納米粒子進行調(diào)控,其二級結(jié)構(gòu)在調(diào)控過程中從α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B。(4)金粒子/絲蛋白納米纖維光熱抑制腫瘤生長對絲蛋白調(diào)控生成的金粒子復(fù)合納米纖維(AuNPs/SF)進行光譜分析。結(jié)果表明,與單分散金納米粒子相比,金納米粒子自組裝體的吸收峰紅移,在近紅外區(qū)域具有更高的光吸收。光熱成像測試表明AuNPs/SF納米纖維在808nm激光照射下具有更高的光熱轉(zhuǎn)換效率。隨后采用乳腺癌細胞MCF-7與Bcap-37及荷瘤裸鼠為模型分別研究了AuNPs/SF納米纖維在體外與體內(nèi)光熱抑制腫瘤的能力。體外實驗表明,經(jīng)過808nm激光照射6min,100μg/mL濃度的AuNPs/SF納米纖維能夠完全殺死MCF-7和Bcap-37細胞,而相同濃度的AuNPs對細胞的致死率只有50%。體內(nèi)實驗表明,對腫瘤原位注射AuNPs/SF納米纖維并進行光照處理能夠有效控制腫瘤生長,光照2周后裸鼠腫瘤接近消失。而PBS組與AuNPs處理組的腫瘤未見明顯抑制現(xiàn)象,仍然繼續(xù)生長。因此,相較于單分散金納米粒子,金粒子/絲蛋白納米纖維能更有效的殺死腫瘤細胞并抑制腫瘤組織的生長。本研究以蠶絲蛋白為模板成功調(diào)控了二氧化硅納米粒子和金納米粒子的自組裝,一方面提高了二氧化硅納米粒子作為藥物載體的載藥效率及對腫瘤細胞的致死能力,另一方面改善了金納米粒子的光學(xué)性質(zhì),增強金納米粒子在近