醫(yī)學統(tǒng)計學第2版第四章抗體制藥

第四章抗體制藥2023/12/3011編輯ppt掌握：單克隆抗體的制備原理、方法及根本過程；單克隆抗體藥物靶標的選擇；基因工程抗體的類型。熟悉：噬菌體抗體庫技術(shù)的原理和根本過程；單鏈抗體、雙特異抗體的制備方法；轉(zhuǎn)基因動物表達抗體的方法。了解：抗體藥物的開展趨勢。學習要求:2編輯ppt第一節(jié)概述第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備第四節(jié)噬菌體抗體庫技術(shù)第五節(jié)轉(zhuǎn)基因動物表達抗體第六節(jié)抗體治療藥物2023/12/303內(nèi)容3編輯ppt第一節(jié)概述一、根本概念抗體〔antibody，Ab〕：指能與相應抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白〔immunoglobulin，Ig〕:具有抗體活性或化學結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白IgAb化學結(jié)構(gòu)上的概念生物學功能上的概念2023/12/304抗體工程制藥：利用基因工程、細胞工程和轉(zhuǎn)基因動植物技術(shù)生產(chǎn)抗體藥物的過程。4編輯ppt2023/12/3055編輯ppt免疫球蛋白〔抗體〕的根本結(jié)構(gòu)1、重鏈和輕鏈重鏈可分為α、δ、ε、γ、μ鏈；輕鏈可分為κ、λ型?？贵w的類型由重鏈類型決定，上述重鏈分別對應了IgAIgDIgEIgGIgM2、可變區(qū)和恒定區(qū)

重鏈和輕鏈N端第一個結(jié)構(gòu)域為可變區(qū)（variableregion,V區(qū))，輕鏈其余的1個及重鏈的3-4個結(jié)構(gòu)域為恒定區(qū)；

V區(qū)存在3個高變區(qū)也稱互補決定區(qū)(complementarity-determiningregion,CDR1~3)及4個骨架區(qū)（frameworkregion,FR1~4).三個高變區(qū)共同組成Ig的抗原識別部位，形成與抗原決定基互補的表位。

6編輯ppt2023/12/3077編輯ppt2023/12/308多克隆抗體：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，對其產(chǎn)生的抗體也是多種抗體的混合物，稱為多克隆抗體。單克隆抗體：針對一個抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的、高度特異、均一、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)的抗體。多抗與單抗8編輯ppt傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細胞多克隆抗體制備過程9編輯ppt1234mmmm12341234單抗細胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗體分開單克隆抗體制備過程10編輯ppt疾病的診斷和治療：診斷:檢測與某些疾病相關(guān)的抗原，輔助臨床診斷。臨床治療：如針對T淋巴細胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體，對器官移植排斥反響有顯著抑制作用，用作免疫抑制劑。作為載體制備導向藥物〔Antibodydrugconjugates,ADC〕治療腫瘤。2023/12/3011抗體的應用11編輯ppt需解決的問題：鼠源性單克隆抗體的免疫原性〔HAMA〕；完整的抗體分子分子量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度；延長半衰期。其他2023/12/301212編輯ppt根本消除了單克隆抗體的鼠源性〔免疫原性〕,鼠源氨基酸只占完整抗體分子的1/80~1/3，只保存同抗原特異性結(jié)合的活性。制備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等很多類型的抗體或抗體單位。2023/12/3013基因工程技術(shù)為解決問題提供了可能13編輯ppt二、抗體工程開展歷程及趨勢1890年，Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素1937年，Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種〔α〕球蛋白、乙種〔β〕球蛋白、丙種〔γ〕球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。1975年，K?hlerandMilstein等首次利用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備出McAb.在臨床上主要用于診斷和治療。1976年，SusumuTouegava〔利根川進〕揭示了抗體多樣性的遺傳學根底。1984年報道了人—鼠嵌合抗體多克隆抗體單克隆抗體基因工程抗體2023/12/301414編輯ppt2023/12/3015整體水平抗體生成技術(shù)細胞工程抗體生成技術(shù)

基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體〔抗血清〕單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體〞〔單鏈抗體〕組合抗體庫技術(shù)

噬菌體抗體庫技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達技術(shù)15編輯ppt商業(yè)化的抗體藥物2023/12/301616編輯pptFDA批準的抗體藥物全抗體37個〔至2021.10月〕抗體片段3個ADC3個〔1個已撤市〕雙特異抗體2個Fc融合蛋白7個鼠源嵌合人源化人源ADC1986OKT31994ReoPro1997RituxanZenapax1998SimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrel2000Mylotarg2001Campath2002ZevalinHumira2003XolairBexxar2004AvastinErbitux2006LucentisVectibix2007Soliris2008Cimzia2009StelaraSinponi2010ActemraNumax2011BenlystaYervoyAdcetris2012PerjetaEylea2013KadcylaGazyva2014CyramzaSylvantEntyvioKeytruda17編輯ppt2014年全球生物藥品銷售額前10名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai12.54RATNF2RemicadeJ&J9.24RA、Crohn’sTNF3RituxanBiogen-IDEC8.678Non-Hopkin’sLymphomaCD204EnbrelAmgen8.538RA、牛皮癬TNF4Lantus(insulinglargine)Sanofi7.279I/II型糖尿病/6AvastinRoche/Genentech6.957結(jié)腸癌，NSCLCVEGF7HerceptinRoche/Genentech6.793乳腺癌，胃癌HER28NeulastaAmgen4.39白細胞減少癥/9LucentisRoche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35貧血及癌癥化療引起貧血/18編輯ppt2021年14個抗體藥物銷售過10億美元2023/12/3019110.265.687.7683.867567.5119編輯ppt生物藥物專利懸崖Pharmaceuticals2021,5,1393-1408生物技術(shù)藥物研發(fā)熱浪涌向中國20編輯ppt重磅化藥銷售Pharmaceuticals2021,5,1393-140821編輯ppt第二節(jié)單克隆抗體及其制備2023/12/3022一、抗體分子的結(jié)構(gòu)與功能二、單克隆抗體的制備22編輯ppt

(1)Fab段2個抗原結(jié)合片段

fragmentwithantigenbinding

(2)Fc段1個可結(jié)晶片段

fragmentcrystallized

Porter木瓜蛋白酶(1)F(ab’)2段1個結(jié)合顆粒性抗原出現(xiàn)凝集反響(2)Fc’段1個無生物學活性Nisonoff胃蛋白酶1、酶解片段一、抗體分子的結(jié)構(gòu)與功能23編輯ppt〔1〕、輕鏈〔lightchain，L鏈〕

214個氨基酸殘基，24KD。分為：κ與λ2個亞型。〔2〕、重鏈〔heavychain，H鏈〕

450-550個氨基酸殘基，55-75KD。分為5類，μ、γ、α、δ、ε鏈。IgM，IgG，IgA，IgD，IgE。

2、重鏈和輕鏈24編輯ppt3、可變區(qū)和恒定區(qū)〔1〕可變區(qū)〔Variableregion，V區(qū)〕

L鏈N端1/2處〔VL〕110個aa;H鏈N端1/5-1/4處〔VH〕118個aa。HVR1，HVR2，HVR3又分別稱為CDR1，CDR2，CDR3

骨架區(qū)（frameworkregion,FR）高變區(qū)（hypervariableregion,HVR）

互補決定區(qū)（complementarity-determiningregion,CDR），

〔2〕恒定區(qū)〔constantregion，C區(qū)〕

L鏈C端1/2處，105個aa;H鏈C端3/4-4/5處，331-431個aa。在同一種屬動物中是比較恒定的,是制備第二抗體進行標記的重要根底。25編輯ppt4、功能區(qū)鏈內(nèi)二硫鍵折疊成球形區(qū)稱為功能區(qū)，約由110個aa組成?！?〕L鏈：2個，VL，CL各1〔2〕H鏈：IgG，IgA，IgD：4個〔V區(qū)1個，C區(qū)3個〕IgM，IgE：5個〔V區(qū)1個，C區(qū)4個〕

〔3〕功能區(qū)的作用：〔a〕VL和VH：結(jié)合抗原決定簇〔FV區(qū)〕〔b〕CL和CH：具有同種異型的遺傳標記〔c〕CH2：結(jié)合補體〔d〕CH3：結(jié)合Fc受體單核細胞，巨噬細胞，粒細胞，B細胞，NK細胞

26編輯ppt5、抗體基因結(jié)構(gòu)2023/12/3027人類編碼Ig的基因分別位于不同的染色體重鏈〔Heavychain)基因：位于14號染色體；輕鏈基因：κ鏈基因位于2號染色體；λ鏈基因位于22號染色體。每條肽鏈的編碼基因可分為V區(qū)和C區(qū)兩大局部。V區(qū)的基因是由不同的基因片段拼接而成的重鏈V區(qū)：由V、D、J片段拼接；輕鏈V區(qū)：由V、J拼接。C區(qū)拼接決定了抗體的類別〔μ、γ、α、δ、ε〕27編輯ppt胚系重鏈的基因結(jié)構(gòu)：(a)鼠(b)人28編輯ppt重鏈的VDJ重組2023/12/302929編輯ppt輕鏈基因胚系及重排后結(jié)構(gòu)30編輯ppt抗體類別轉(zhuǎn)換2023/12/303131編輯pptV區(qū)功能：識別并特異性結(jié)合抗原C區(qū)功能：激活補體系統(tǒng)：抗體與抗原結(jié)合形成復合物可通過啟動C1q激活補體經(jīng)典途徑及補體旁路途徑；介導免疫細胞活性：抗體的調(diào)理作用；ADCC作用；介導超敏反響。穿過胎盤和黏膜：IgG是唯一能從母體通過胎盤屏障轉(zhuǎn)運到胎兒體內(nèi)的抗體；IgA合成的主要作用部位在黏膜，是黏膜局部抗感染的主要物質(zhì)。2023/12/30325、抗體的功能32編輯ppt2023/12/303333編輯ppt抗體功能〔C區(qū)〕-ADCC2023/12/303434編輯ppt抗體功能〔C區(qū)〕-CDC2023/12/3035IgG4、IgA、IgE35編輯ppt二、單克隆抗體及其制備2023/12/3036抗原與動物免疫細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)篩選陽性克隆與克隆化雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的純化36編輯ppt單克隆抗體制備原理3737編輯ppt單克隆抗體制備的根本技術(shù)1、抗原與動物免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原；制備特定抗原的單克隆抗體，要制備用于免疫的適當抗原，再用抗原進行動物免疫。可以用化學合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物用整個腫瘤細胞做為免疫原，經(jīng)過篩選、克隆化，制備出僅存在于腫瘤細胞而不存在于正常細胞上的外表標志分子的單克隆抗體。免疫動物：BALB/c小鼠或Lou大鼠；目前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠。免疫方法：體內(nèi)免疫和體外免疫(體外致敏淋巴細胞)。38編輯ppt體內(nèi)免疫法：適用于免疫原性強、抗原量較多時應用，一般用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原〔細胞抗原〕的免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔107個細胞進行初次免疫，間隔1～3周，追加免疫1～2次?？扇苄钥乖喊?0～100μg抗原/小鼠與福氏完全佐劑和滅活的分枝桿菌等量混合后注入腹腔內(nèi)，進行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾細胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細胞分裂。39編輯ppt二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)根本方法：脾細胞〔1*108〕與骨髓瘤細胞〔2*107~3*107〕混合，在PEG作用下誘導融合(2min)，用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。骨髓瘤細胞：SP2/0、P3.653，為缺陷性。PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑；常用濃度為40%~50%，相對分子質(zhì)量4000為佳。為了提高融合率，在PEG溶液中參加DMSO，以提高細胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴格限制接觸時間。作用機理：誘導細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜易翻開而有助于細胞融合40編輯ppt細胞融合的步驟：將免疫脾細胞和小鼠骨髓細胞以2：1～10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)200rpm離心7—10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細胞鋪展成薄層在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴參加50%的PEG0.5ml，隨后靜置60秒再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴參加5－10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用再靜置10分鐘。41編輯ppt可生產(chǎn)有用抗體的淋巴細胞假設與癌細胞融合，那么形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細胞株。癌細胞可培養(yǎng)生長漿細胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個Bcell只產(chǎn)生一種抗體42編輯ppt細胞融合液中如何去除脾-瘤以外的融和細胞？

解決方法：選擇性培養(yǎng)基(HAT〕

43編輯pptHAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞HAT是含一定濃度次黃嘌呤〔H〕、氨基喋呤〔A〕及胸腺嘧啶核苷〔T〕的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細胞DNA合成有關(guān)。44編輯pptm核酸補救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶胸腺嘧啶核苷激酶葉酸拮抗物45編輯ppt2023/12/304646編輯ppt選擇性培養(yǎng)方法：將融合的細胞懸浮于HAT的培養(yǎng)液，參加到96孔板內(nèi)每2~3天換液一次。換液時吸去1/2~2/3培養(yǎng)液，參加等量的新鮮培養(yǎng)液。7天內(nèi):用HAT培養(yǎng)液，殺死瘤-瘤融合細胞后，第7~14天:改用HT培養(yǎng)液，14天以后:用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。從融合后8~9天就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進行抗體檢測，篩選出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。47編輯ppt大量細胞在HAT培養(yǎng)基中死亡，單個或少數(shù)雜交瘤細胞不易存活？解決方法：飼養(yǎng)細胞小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞、胸腺細胞最適的條件下,105個脾細胞形成1個雜交瘤細胞，大量瘤細胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個或少數(shù)的雜交瘤細胞多半不能存活，參加飼養(yǎng)細胞才能使其繁殖。48編輯ppt原因:飼養(yǎng)細胞能釋放某些生長刺激因子能滿足雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性小鼠腹腔巨噬細胞還能去除死亡細胞，故應用較多。49編輯ppt三、篩選陽性克隆與克隆化〔1〕篩選陽性克隆：產(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細胞:占所有脾細胞的5%微量、快速、特異、敏感、簡便，并一次能檢測大批標本的方法。檢測方法：免疫酶技術(shù)；免疫熒光技術(shù)；放射免疫技術(shù)；FACS2023/12/305050編輯pptELISA51編輯ppt1、精制破傷風毒素抗原〔〕吸附〔約10g/ml，4℃，3h〕洗滌2、加雜交瘤培養(yǎng)上清液〔〕〔4℃，1h〕3、加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體〔〕〔4℃，1h〕洗滌洗滌4、加酶作用底物，呈色孔為陽性克隆孔ELISA用于破傷風抗體的篩選2023/12/305252編輯ppt〔2〕克隆化——有限稀釋法和軟瓊脂法應盡早克隆化:含不分泌細胞,多株分泌細胞,染色體易喪失克隆化：單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程。其中每個細胞的生物學特征和功能完全相同。一般3次克隆化，才能到達100%孔內(nèi)均為抗體陽性細胞克隆。常用的克隆化方法有：有限稀釋法、軟瓊脂法、流式細胞法。2023/12/305353編輯ppt有限稀釋法：通過適當?shù)南♂尩竭_別離單個細胞進行培養(yǎng)的目的：雜交瘤細胞懸液稀釋，參加到96孔細胞培養(yǎng)板，使每個孔中在理論上只含有一個細胞。例：取出陽性孔內(nèi)的細胞進行計數(shù)；用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個細胞；如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，其機率將為每孔內(nèi)落入一個細胞；參加一定數(shù)量的飼養(yǎng)細胞，經(jīng)過8~12天后，可觀察到有集落生長的孔；據(jù)檢測的陽性結(jié)果再次進行克隆化。2023/12/305454編輯ppt軟瓊脂法：培養(yǎng)液中參加0.5%左右的瓊脂糖凝膠細胞分裂后形成小球樣團塊，用毛細吸管將小球吸出團塊打碎后移入96孔板繼續(xù)培養(yǎng)可吸出大量克隆細胞進行培養(yǎng)，因初代細胞很不易增殖，所以該法容易成功。2023/12/305555編輯ppt

四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定〔一〕雜交瘤細胞鑒定：鼠脾細胞染色體數(shù):40，端著絲粒;小鼠骨髓瘤細胞染色體:SP2/0細胞為62~68，NS-1為54~64，中部和亞中部著絲點;雜交瘤細胞的染色體數(shù)目:親本細胞數(shù)目總和，多數(shù)為端著絲粒，少數(shù)標志染色體;染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細胞分泌高效價的抗體；56編輯pptIg類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反響效價測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

表位測定：競爭抑制法親和性測定：測定親和常數(shù)K雜交瘤細胞染色體：秋水仙素裂解法McAb靶抗原分子量：常用westernblot〔二〕抗體性狀鑒定57編輯ppt五、單克隆抗體的制備〔1〕體外培養(yǎng)法：可獲得10g/ml的抗體；多采用RPMI1640培養(yǎng)液，添加10%~20%胎牛或小牛血清?！?〕動物體內(nèi)誘生法：可獲得5~20mg/ml的抗體。目前多采用2023/12/305858編輯ppt體內(nèi)誘生法：因為雜交瘤細胞的兩種親本細胞均來自BALB/c小鼠，所以應選用BALB/c小鼠來制備單克隆抗體?？捎谧⑷爰毎膸字芮?，預先將具有刺激性的有機溶劑降植烷〔pristane〕注入腹腔內(nèi)，以破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤易于增殖的環(huán)境。優(yōu)點：操作簡便，經(jīng)濟，所得單克隆抗體量較多且效價亦高，還可有效地保存雜交瘤細胞株和別離已污染雜菌的雜交瘤細胞株2023/12/305959編輯ppt小結(jié)60編輯ppt61編輯ppt六、單克隆抗體的純化動物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體具體純化方法及過程1、澄清和沉淀處理離心1000g×5min：去除殘留的小顆粒物質(zhì)〔小鼠腹水中含有紅細胞、細胞碎塊、纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等〕；0.2m的微孔濾膜過濾：除掉污染的細菌、支原體和脂質(zhì)；用飽和硫酸銨沉淀抗體：50%飽和硫酸銨能回收90%以上的單克隆抗體。2023/12/306262編輯ppt1.名詞解釋：抗體；免疫球蛋白；多克隆抗體；單克隆抗體2.單克隆抗體有哪些缺乏？如何改造？3.大量制備單克隆抗體的方法主要有哪些？4.制備單克隆抗體的一般流程是什么？〔如何制備雜交瘤細胞？〕思考題2023/12/306363編輯ppt第三節(jié)基因工程抗體基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導入受體細胞進行表達，產(chǎn)生新型抗體。目的：保存天然抗體的特異性和主要生物活性，去除或減少無關(guān)結(jié)構(gòu)及鼠源單抗缺乏；賦予抗體分子新的生物活性。原理：抗體同抗原結(jié)合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)〔V〕，同種性免疫源性那么決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)〔C〕。64編輯ppt內(nèi)容1、人-鼠嵌合抗體〔ChimericAntibody〕2、人源化改型抗體〔HumanizedAntibody〕3、單鏈抗體4、單域抗體與分子識別單位5、雙功能抗體6、抗體融合蛋白2023/12/306565編輯ppt基因工程抗體的類型人-鼠嵌合抗體改型抗體〔人源化抗體〕FabFv單鏈抗體單域抗體最小識別單位抗體融合蛋白2023/12/3066單域抗體最小識別單位單鏈抗體小分子抗體66編輯ppt1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)

人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。67編輯pptPr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細胞啟動子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略構(gòu)建嵌合抗體過程：鼠源單抗的可變區(qū)基因連到包含有人抗體恒定區(qū)基因并構(gòu)建到表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。68編輯ppt鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細胞人-鼠嵌合基因工程抗體69編輯ppt2人源化改型抗體(Reshapingantibody)鼠單克隆抗體V區(qū)的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強的免疫反響。為了進一步降低抗體的鼠源成分，開展出CDR移植技術(shù)。CDR移植:即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體〔humanizedantibody)。70編輯ppt

經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變結(jié)合半抗原及全抗原(如細胞外表受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體?！裁绹缴鲜械?8種治療性單抗中多數(shù)是人源化抗體〕71編輯ppt人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成假設干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進一步即可用于構(gòu)建和表達改形抗體。72編輯ppt定點突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達出改型抗體。研究說明，在構(gòu)建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時還必需包括對影響抗原結(jié)合位點的空間結(jié)構(gòu)的框架序列〔FR〕進行操作。73編輯ppt單鏈抗體(singlechainFv,scFv)P154:由一段彈性連接肽〔linker〕把可變區(qū)重鏈〔VH〕與輕鏈〔VL〕相連而成，具有親代抗體全部抗原結(jié)合特異性的最小功能結(jié)構(gòu)單位。連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，具有一定彈性和蛋白酶抗性，常用的連接肽是(GGGGS)3它應具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點。

3單鏈抗體〔ScFv〕Fv由于其結(jié)合是非共價結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定,在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到單鏈抗體。74編輯ppt分子小，保持完整抗原結(jié)合位點，易進入組織；易于進行分子改造，融合毒素、酶、藥物等構(gòu)成雙功能抗體。免疫原性低；可在大腸桿菌中表達；缺乏Fc段，不與非靶細胞〔Fc受體陽性細胞〕結(jié)合，易進入組織，偶聯(lián)成像可用于診斷；體內(nèi)半衰期短易從血循環(huán)中去除；親和力和穩(wěn)定性較完成抗體低；因只能與抗原結(jié)合，不能激活補體激活細胞免疫〔CDC〕及抗體依賴細胞毒效應〔ADCC〕。2023/12/3075單鏈抗體〔ScFv〕特點75編輯ppt單鏈抗體的構(gòu)建在親本DNA序列時可用完全人工合成法;從雜交瘤細胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用PCR方法擴增可變區(qū)基因VH,VL，將二者連接成ScFv基因，再組裝到適當?shù)谋磉_載體上。ScFv的基因構(gòu)建76編輯ppt

單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌，有2種方式:

一是表達為包涵或非包涵體的不溶蛋白。但需進行變性復性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復抗體活性;

二是分泌型表達，將細菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細菌體外，進行折疊后成為有活性的分子。重組ScFv的表達77編輯ppt雙價及多價ScFv2023/12/3078連接肽〔linker〕較短時，同一ScFv分子內(nèi)VH與VL不能相互配對，分子間的VH，VL功能區(qū)配對成一個二價的二聚體，也可構(gòu)成三聚體或多聚體。78編輯ppt

抗體的VH、VL約為完整分子的1/12,只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。

4、單域抗體和分子識別單位VH分子識別單位：約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。79編輯ppt即雙特異性抗體(bispecificantibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。5、雙〔多〕功能抗體80編輯ppt

Hollinger等將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達質(zhì)粒中,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達質(zhì)粒,目前報道的表達質(zhì)粒均為雙順反子。表達后,VLAVHB與VHAVLB交叉連結(jié),形成雙特異性抗體。81編輯ppt雙功能抗體實例能結(jié)合靶腫瘤細胞又能結(jié)合高細胞毒性的效應細胞,將效應細胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細胞外表引發(fā)分子結(jié)合,激活效應細胞,實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷和裂解。與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應細胞再導向至腫瘤細胞處,從而使效應細胞的抗腫瘤活性增強,發(fā)揮免疫導向作用,這是腫瘤治療的新突破。82編輯pptCatumaxomab2023/12/308383編輯ppt多功能抗體

84編輯ppt6、抗體融合蛋白將抗體片段〔V區(qū)或C區(qū)〕連接到與抗體無關(guān)的其他蛋白上，創(chuàng)造出抗體相關(guān)分子，稱為抗體融合蛋白〔antibodyfusionprotein〕。分類：Fv抗體融合蛋白：抗體的Fv與其他生物活性蛋白結(jié)合，主要用于導向治療領(lǐng)域。Fc抗體融合蛋白：抗體Fc段與某些有黏附或結(jié)合功能的蛋白質(zhì)融合而獲得的融合蛋白。2023/12/308585編輯pptFv-抗體融合蛋白抗體與毒素、酶、細胞因子等生物活性分子融合到達特異殺傷腫瘤細胞目的。抗體與毒素偶聯(lián)：綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒素〔II期〕；抗體與酶蛋白融合：也稱為抗體酶〔abenzyme〕，前體藥物療法〔ADEPT〕；抗體與細胞因子融合：IL-2，免疫介導療法；2023/12/308686編輯pptFc-抗體融合蛋白具有與特定蛋白〔ProteinA,ProteinG〕結(jié)合的特點，便于檢測與純化；Fc介導的抗體效應功能，如：ADCC、CDC及免疫調(diào)理作用；延長蛋白在血液中的半衰期；實例：CD4-Fc;CTLA4-Fc;TNFaR-Fc;VEGFR-Fc(VEGF-TRAP)2023/12/308787編輯ppt2023/12/308888編輯ppt思考題一、名詞解釋1、可變區(qū)2、恒定區(qū)3、互補決定區(qū)4、功能區(qū)5、人—鼠嵌合抗體6、改形抗體7、Fab抗體8、Fv抗體9、單鏈抗體〔scFv〕10、單域抗體11、雙特異單鏈抗體〔bisFvs〕二、簡答1、簡述抗體的結(jié)構(gòu)與功能、抗體多樣性的遺傳學根底。2、基因工程抗體有哪些類型？其特性有何不同？3、抗體融合蛋白有哪些類型，特征和設計策略是什么？試舉例說明。4、多價抗體特點？2023/12/308989編輯ppt

第四節(jié)噬菌體抗體庫技術(shù)抗體研究的三個階段：①以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表，其特點是用抗原免疫動物來獲得多克隆抗體；②以1975年K?hler創(chuàng)立雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體為代表；③以1994年Winter以基因工程方法制備抗體為代表。抗體研究領(lǐng)域的一次技術(shù)革命，完全用基因工程技術(shù)制備人源化抗體，還能利用基因轉(zhuǎn)移和表達技術(shù)，通過細菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體。在此根底上開展成抗體工程。Winter創(chuàng)立了噬菌體抗體庫〔Repertoireofantibodiesdisplayedonphages〕技術(shù),克服了人體不能隨意免疫的缺點，用人外周血制備抗體文庫，從而獲得人源性基因工程抗體。90編輯ppt將蛋白分子或多肽基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，使噬菌體外表表達該異源分子，稱為噬菌體展示。將B細胞全套可變區(qū)基因克隆，插入絲狀噬菌體表達載體轉(zhuǎn)化工程菌進行表達，在噬菌體外表形成噬菌體抗體的群體，即為噬菌體抗體庫〔surfacedisplayantibodylibrary〕。噬菌體展示抗體庫技術(shù)91編輯ppt用PCR擴增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因〔獲取目的基因〕克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達在其外殼外表〔載體構(gòu)建〕用抗原抗體反響篩選出表達所需要抗體的克隆并擴增?！蔡院Y和鑒定〕使抗體基因以分泌的方式表達，篩選可溶性的抗體片段?？贵w庫：組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機組合人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經(jīng)免疫的正常人一、根本原理和程序92編輯ppt噬菌體抗體庫93編輯ppt絲狀噬菌體基因基因編碼產(chǎn)物功能gIpI噬菌體裝配gIIpII噬菌體基因組復制gIIpIII尾端外殼蛋白，與F因子結(jié)合gIVpIV噬菌體裝配gVpV噬菌體基因組復制gVIpVI外殼蛋白，末端“塞子”gVIIpViI外殼蛋白，高度疏水，組裝起始信號gVIIIpVIII主要外殼蛋白gIXpIX外殼蛋白，高度疏水，末端“塞子”gXpXgIII啟動子激活蛋白94編輯ppt95編輯ppt96編輯ppt噬菌體外表展示文庫技術(shù)的要點外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導系列的緊靠下游隨機克隆入相應載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細胞中PCR擴增抗體全套基因片段97編輯ppt用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴增〞數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細菌的質(zhì)周腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，98編輯ppt1、獲取目的基因：提取RNA，經(jīng)RT-PCR獲取抗體某一特定基因區(qū)段。2、抗體庫技術(shù)的載體：普遍使用噬菌粒〔phagemid〕載體。3、淘篩〔panning〕：用固相化抗原對表達產(chǎn)物的載體進行淘篩，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量擴增。4、表達與鑒定：目的克隆經(jīng)過鑒定后，再導入感受態(tài)菌珠，進行可溶性表達，其產(chǎn)物用Westernblot分析確定后，就完成了全過程。噬菌體抗體庫技術(shù)的根本方法小結(jié)99編輯ppt二、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點1、模擬天然全套抗體庫抗體文庫可以到達或超過1011庫容，所以能包含B細胞全部克隆。建庫的外源基因來自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴增，這是人體多克隆細胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性?？贵w的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性。100編輯ppt2、避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)由于抗體庫的大容量和極高的篩選效率，使得可以調(diào)出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能防止使用人工免疫動物和細胞融合技術(shù)。3、可獲得高親和力的人源抗體在噬菌體抗體庫技術(shù)中，VH和VL基因的隨機重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程，所用的抗體基因又來自人體，因此，所產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體。101編輯ppt將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來;可繞過雜交瘤技術(shù)，不需要復雜的基因工程技術(shù);抗體基因篩選的范圍廣;技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)?；a(chǎn);適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機多肽等的生產(chǎn)。該項技術(shù)的優(yōu)點:102編輯ppt噬菌體抗體庫技術(shù)的開展具有很大優(yōu)越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識別一增殖過程上模擬了B細胞的成熟過程，從而在實際應用上具有很大意義。使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體外表，利用親和層析，兩輪富集達106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。103編輯ppt

第六節(jié)抗體治療藥物

自第一個抗體藥物批準上市以來，已被成功用于治療腫瘤、自身免疫疾病等多種“疑難雜癥〞，截止2021年6月，美國FDA批準28種抗體藥物，抗腫瘤占53.8%，免疫性疾病：19.2%、器官移植11.5%、感染性疾病7.7%、心血管疾病3.8%、其他3.8%。104編輯ppt商業(yè)化的抗體藥物2023/12/301055個靶標的抗體仿制藥開發(fā)是熱點:CD20，HER2，EGFR,VEGF,TNF-alpha105編輯ppt2023/12/30106VEGFTargetAnti-VEGFStrategy106編輯pptHER2signalingpathwayandAnti-HER2Strategy107編輯pptCombinationstrategiestopotentiatecellularresponseandovercomeresistanceNancyE.Hynes

andHeidiA.Lane.ERBBreceptorsandcancer:thecomplexityoftargetedinhibitors.NatRevCancer.2005;5:341-354.108編輯ppt2013年全球生物藥品銷售額前10名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai11.00RATNF2EnbrelAmgen8.76RA、牛皮癬TNF3RemicadeJ&J8.37RA、Crohn’sTNF4Lantus(insulinglargine)Sanofi7.95I/II型糖尿病/5RituxanBiogen-IDEC7.91Non-Hopkin’sLymphomaCD206AvastinRoche/Genentech6.97結(jié)腸癌，NSCLCVEGF7HerceptinRoche/Genentech6.91乳腺癌，胃癌HER28NeulastaAmgen4.39白細胞減少癥/9LucentisRoche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35貧血及癌癥化療引起貧血/109編輯ppt2021年14個抗體藥物銷售過10億美元2023/12/30110110.265.687.7683.867567.51110編輯ppt抗體藥物分類抗體或抗體片段〔小分子抗體藥物〕抗體融合蛋白抗體偶聯(lián)物或免疫偶聯(lián)物2023/12/30111抗體與放射性同位素偶聯(lián)抗體與抗癌化學藥物偶聯(lián)抗體與免疫毒素偶聯(lián)111編輯ppt一、放射性同位素標記的抗體治療藥物抗體作為放射性同位素的導向載體，體內(nèi)應用較成功。----同位素標記抗體操作簡便，用量小，可觀測藥物在體分布和藥物動力學。----治療起步階段，人體研究較少。----初步結(jié)果證明放射性同位素標記的抗體對腫瘤細胞殺傷較大。

----同位素來源困難，防護和污染問題112編輯ppt1、常用的抗癌藥物

氨甲喋呤(MTX)阿霉素(ADM)絲裂霉素(MMC)環(huán)磷酰胺(CTX)新抑癌蛋白(NCS)正定霉素(DOX)-------抗體藥物偶聯(lián)物提高體外細胞毒性，對化學療法耐藥的細胞株仍有效。二、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物113編輯ppt抗體-藥物偶聯(lián)體由三個局部組成靶向單克隆抗體穩(wěn)定的連接子高活性小分子藥物抗體-藥物偶聯(lián)體是一類新型的