研究生專業(yè)技能訓(xùn)練-唐雪

RNA提取及PT-PCR技術(shù)研究生分子生物學(xué)實驗唐雪食品營養(yǎng)與功能因子研究中心D117Tel:85917780E-mail:基因表達(GeneExpression)

細胞在生命過程中，把儲存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。生物體內(nèi)的各種功能蛋白質(zhì)和酶都是同相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因編碼的。

對這個過程的調(diào)節(jié)即為基因表達調(diào)控(RegulationofGeneExpressionorGeneControl)。

①轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控；

②mRNA加工、成熟水平上的調(diào)控；

③翻譯水平上的調(diào)控

Gene(DNA)TranscriptionmRNAProteinCellularFunctionTranslationmRNA每一個真核細胞約含5-10μgRNA80-85%是rRNA〔主要是28S、18S和5SrRNA〕10-15%tRNA和核內(nèi)小分子RNA1-5%的mRNA

分子量不均一3′末端有polyA組成的尾，利用寡聚〔dT〕親和層析柱別離提取高純度完整的RNA，是研究基因表達、體外轉(zhuǎn)錄、構(gòu)建cDNA文庫、RT-PCR、Northern雜交的重要根底環(huán)節(jié)實驗安排第一次課〔全天〕實驗一小鼠肝臟總RNA提取〔上午〕實驗二PCR技術(shù)擴增特異性DNA片段〔一〕〔下午〕第二次課實驗二PCR技術(shù)擴增特異性DNA片段〔二〕實驗一小鼠總RNA提取TRIzol法TRIzol中含有RNase抑制劑〔異硫氰酸胍、β-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉〕增強核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA與蛋白別離在參加氯仿離心后，溶液分為水相和有機相，RNA選擇性地進入無蛋白和DNA的水相中，容易被異丙醇沉淀異丙醇使RNA沉淀濃縮本卷須知實驗成敗的關(guān)鍵：嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性全部實驗過程中均需戴手套〔使用一次性手套〕、口罩操作所用的玻璃器皿、塑料容器等均需進行處理前方可使用〔詳見本卷須知〕實驗所用試劑可用含有0.1%DEPC121℃高壓滅菌處理后的水配置實驗步驟1.動物在實驗前禁食8-10小時。取100mg新鮮肝組織加1mLTRizol〔預(yù)冷〕試劑，于冰浴勻漿，勻漿速度要快，使肝組織迅速接觸到變性劑，防止組織內(nèi)源RNA酶的污染。然后將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，室溫靜置10min；注意：高蛋白，脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨后須4℃12000離心10min去掉不溶物，再進行后面操作。2.參加200uL〔或1/5體積〕氯仿，充分混合30s，室溫靜置5min，分層。4℃12000rpm離心15min，離心管中液體分為3層：上層為水相，RNA在此相中，蛋白質(zhì)在下層黃色的有機相中，DNA保存在上下兩層的界面處的中間層；3.小心吸取上層水相約0.4mL〔或<0.4mL〕于新的塑料離心管中〔切勿吸取中間層和下層液體〕。參加等體積的4℃預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，室溫放置20min〔或-20℃靜置30min以上〕；4.4℃12000rpm離心15min，沉淀RNA，棄上清；5.用1mL預(yù)冷的75%乙醇〔DEPC水配制〕洗滌沉淀，12000rpm4℃離心10min，棄盡上清；6.重復(fù)步驟5，然后室溫中自然枯燥約10min，至RNA呈半透明狀即可(用10μl槍小心吸取多余乙醇)；7.根據(jù)RNA提取量加20-100μLDEPC〔50μL〕處理的水溶解沉淀，56℃水浴10min，立即置于冰上，得到所提取的RNA溶液；8.如須保存，可加0.1體積的3M醋酸鈉〔pH5.2〕和2.2倍體積的冰無水乙醇，充分混勻，于-70℃低溫保存?；蛴梅€(wěn)定的甲酰胺溶〔4mg/mL〕,-20℃保存，用時，4倍乙醇沉淀，回收RNA。RNA純度、濃度測定及分子完整性的鑒定RNA是否能用于后續(xù)實驗，取決于它的純度和分子的完整性，常用的鑒定方法是測定樣品260nm與280nm的光吸收值以及電泳顯示RNA分子是否降解。1.260nm/280nm光吸收比值取10μL總RNA樣品，加990μLDEPC水〔配2mL〕，混勻，測同一樣品在260nm和280nm光吸收值〔A260和A280〕2.計算RNA純度=A260/A280比值范圍<1.8，RNA樣品有蛋白質(zhì)或酚〔苯環(huán)物質(zhì)〕污染，需要用氯仿重新抽提。>2.0，核苷酸降解RNA濃度〔μg/mL〕=A260×40×〔1/光徑〕×稀釋倍數(shù)〔100倍〕提取的RNA濃度約1-5μg/μL為宜RNA電泳〔甲醛變性凝膠電泳〕RNA提取的成功與否是RT-PCR檢測中最重要的步驟用途:

檢測細胞中基因表達水平檢測基因表達細胞中RNA病毒的含量直接克隆特定基因的cDNA序列注意問題：mRNAcDNAOligodT,逆轉(zhuǎn)錄酶特異性引物,Taq酶PCRRNA的反轉(zhuǎn)錄〔RT〕和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增〔PCR〕相結(jié)合的技術(shù)模板RNA：總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物實驗二PCR技術(shù)擴增特異性DNA片段(RT-PCR)適用于mRNA表達量解析?TwoStepRT--PCR效率高?使用Random和Oligo--dT引物可以制備cDNApool?cDNA可長期保存TwoStepRT--PCR1.逆轉(zhuǎn)錄(RT)第一步〔10μL〕RNA(1ug/uL)2uLdNTP(10mM)2uLOligo(0.5ug/uL)2uLDEPC水4uL①70℃,5min②4℃5×buffer5uLRnaseI(40u/uL)0.2uLM-MLV(200u/uL)0.5uLDEPC水9.3uL①37℃,1h②95℃,5min③4℃(或-20℃長期保存)第二步〔15μL〕1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸③高溫變性①低溫退火②重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍2.PCRtext1tex2text3標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L10×擴增緩沖液H2OPCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA94℃50℃PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點56℃引物1引物2DNA引物72℃PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點72℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶95℃PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點94℃第1輪結(jié)束第2輪開始56℃72℃PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點72℃TaqTaqTaqTaqPCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增PCR產(chǎn)物生成曲線log[DNA]CyclesPCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察3-4小時2.基因擴增〔β-actin〕5×buffer2.5uLdNTP（2.5mM）2uLMg2+1.5uL上游引物

（10pM）2uL下游引物(10pM)2uLcDNA2uLTaq酶（4u/uL）0.1uLH2O

13.4uL34Cycle94℃5min,

94℃30s,55℃30s,72℃1min,72℃10min,4℃

34循環(huán)PCR具有極高的靈敏度樣品正對照負對照標(biāo)準(zhǔn)分子量污染是PCR實驗的常見問題。只要實驗室里曾經(jīng)擴增過某個片段，就有可能以后的實驗中發(fā)生污染。因此，做實驗的時候絕對不要忘了負對照。用紫外燈破壞污染物也是一個方法text1text2text3不同樣品有不同的生成曲線log[DNA]Cycles舉例內(nèi)參選定，共同擴增－原理：PCR反響體系中參加熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)控PCR整個進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析Ct值2.Real-TimePCR〔實時定量〕－用途：組織的基因表達分析，應(yīng)用非常廣泛－優(yōu)點：靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現(xiàn)多重反響、自動化程度高、無污染性、具實時性和準(zhǔn)確性等特點Cycle1Cycle3Cycle2SYBRgreen①SYBRgreen作用原理MolecularProbe公司的一個專利產(chǎn)品，USPatent5,436,134,1993年7月12日申請SYBRgreen的優(yōu)缺點簡便可以使用已有的引物普遍通用可以檢測所有的雙鏈DNA，包括引物二聚體需要化大力氣優(yōu)化反響條件，以消除非特異性擴增價格$1/PCR反響定量的靈敏度有所欠缺②TaqMan體系A(chǔ)BI公司首先推出(PRISM7000系列)USPatent5,723,591,1995年11月申請。實時檢測:

每個循環(huán)都會產(chǎn)生與P