生化研究技術(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)（酶）、核酸的分

生命科學(xué)根底實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心生物化學(xué)技術(shù)原理部分第一章蛋白質(zhì)〔酶〕、核酸的分別純化第三章層析技術(shù)第二章離心技術(shù)第四章電泳技術(shù)第一章蛋白質(zhì)〔酶〕、核酸的分別純化第一節(jié)引言一、分別純化的意義二、分別純化的要求三、分別純化的普通程序第二節(jié)蛋白質(zhì)〔酶〕、核酸分別純化的前處置一、資料的選擇與預(yù)處置二、細(xì)胞的破碎三、細(xì)胞器的分別四、提取第三節(jié)分別純化一、粗提純二、精提純?nèi)⒓兌辱b定第四節(jié)生物大分子的濃縮、枯燥及保管第一節(jié)引言蛋白質(zhì)〔酶〕、核酸存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子；蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)、防御、調(diào)控及記憶、識(shí)別等多種生理功能；核酸是遺傳信息的攜帶者，在生物體中指點(diǎn)各種蛋白質(zhì)的合成。性質(zhì)方法分子大小透析、超濾、差速離心、凝膠過(guò)濾溶解度等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀電荷電泳、離子交換層析吸附性質(zhì)吸附層析對(duì)配體分子的生物親和力親和層析生物大分子的分別純化的方法很多，主要是根據(jù)分子之間特異性的差別，如分子大小、溶解度、電荷等建立起來(lái)的。一、分別純化的意義①?gòu)纳镔Y料中分別制備蛋白質(zhì)、核酸，研討其構(gòu)造與功能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命景象的本質(zhì)有艱苦意義；②工業(yè)消費(fèi)的需求：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需求大量的高活性的酶制劑；〔如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等〕③醫(yī)療的需求：如用豬胰島素治療糖尿??；④基因工程的需求。二、分別純化的要求1、純度：主要取決于研討的目的和運(yùn)用上的要求。如作為研討其一級(jí)構(gòu)造和空間構(gòu)造的蛋白、一級(jí)構(gòu)造與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和規(guī)范蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面運(yùn)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，到達(dá)一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子堅(jiān)持天然構(gòu)象形狀，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分別純化過(guò)程中總有不少損失，而且提純步驟越多，損失越大。三、分別純化的普通程序生物大分子的分別純化普通可分為以下幾個(gè)階段：①資料的選擇和預(yù)處置；②破碎細(xì)胞及提取〔有時(shí)還需求進(jìn)展細(xì)胞器的分別〕；③分別純化：包括粗分級(jí)分別和細(xì)分級(jí)分別。其中前兩個(gè)階段為生物大分子分別純化的前處置。第二節(jié)蛋白質(zhì)〔酶〕、核酸

分別純化的前處置一、資料的選擇與預(yù)處置選擇資料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā９I(yè)消費(fèi)上留意選擇含量高、來(lái)源豐富、易獲得、制備工藝簡(jiǎn)單、本錢(qián)低的動(dòng)植物組織或微生物做原料。科研選材那么無(wú)需思索上述問(wèn)題，只需能到達(dá)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯?。?shí)驗(yàn)資料選定后，經(jīng)常需求進(jìn)展預(yù)處置，如動(dòng)物資料需求除去一些與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織；植物種子需求除殼；微生物需求將菌體與發(fā)酵液分開(kāi)。另外，必需盡能夠堅(jiān)持資料的新穎，盡快加工處置，假設(shè)不立刻進(jìn)展實(shí)驗(yàn)或加工，應(yīng)冷凍保管。二、細(xì)胞的破碎分別提取某終身物大分子，首先要求生物大分子從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的形狀釋放出來(lái)，并堅(jiān)持原來(lái)的天然形狀，不喪失其生物活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但假設(shè)資料是體液〔如血〕或生物體分泌到體外的分泌物，那么不用進(jìn)展組織細(xì)胞的破碎。組織細(xì)胞的破碎方法很多，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)規(guī)模，不同的實(shí)驗(yàn)資料和實(shí)驗(yàn)要求，運(yùn)用的破碎方法和條件也不同。普通動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處置破碎；植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，普通常用與石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂煌心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處置也能到達(dá)目的；細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難，由于整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實(shí)踐上是一借共價(jià)鍵銜接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處置〔以分解肽聚糖〕。三、細(xì)胞器的分別細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細(xì)胞還有葉綠體。假設(shè)要分別制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大分子，為了防止其他細(xì)胞組分中的物質(zhì)對(duì)制備物的干擾或污染，還需先將細(xì)胞器分別出來(lái)，然后在某一細(xì)胞器中分別某一物質(zhì)。細(xì)胞器的分別普通采用差速離心法，即將破碎后的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)展離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過(guò)不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，即可獲得所需組分。四、提取組織細(xì)胞破碎過(guò)程中，大量的胞內(nèi)酶及細(xì)胞內(nèi)含物被釋放出來(lái)，必需立刻將其置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡能夠堅(jiān)持原來(lái)的天然形狀，防止因長(zhǎng)久放置呵斥制備物的分解破壞，這就是提取。提取實(shí)踐上就是將制備物從復(fù)雜的生物體系中轉(zhuǎn)移到特定的人工液相體系中〔通常是水、緩沖液、稀鹽溶液或有機(jī)溶劑〕。1、蛋白質(zhì)〔酶〕的提取大多數(shù)蛋白質(zhì)均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中，故蛋白質(zhì)的提取普通以水溶液提取為主。通常采用類(lèi)似生理?xiàng)l件下的緩沖液，如20-50mmol/L的磷酸鹽緩沖液〔pH7.0-7.5〕或0.1mol/LTris-HCl〔pH7.5-8.0〕緩沖液作提取液。對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較結(jié)實(shí)或分子中非極性較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽、稀堿、稀酸，常在提取液中參與適量的有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。2、核酸的提取DNA和RNA在細(xì)胞中常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白的方式存在。DNA的提?。浩胀ㄊ抢肈NA-核蛋白〔DNP〕易溶于1mol/LNaCl溶液。RNA的提?。豪肦NA-核蛋白〔RNP〕易溶于0.14mol/LNaCl溶液，先提獲得到RNP。提獲得到DNP或RNP后，再將蛋白質(zhì)除去即可得到相應(yīng)的核酸。蛋白質(zhì)的去除可以選擇去污劑法或有機(jī)溶劑法。去污劑法是利用SDS等陰離子去污劑與蛋白質(zhì)帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，從而使核酸與蛋白質(zhì)分開(kāi)。然后參與濃醋酸鉀溶液，使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀，并使多余的SDS轉(zhuǎn)化為溶解度小的鉀鹽而同時(shí)沉淀。有機(jī)溶劑法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白質(zhì)的變性劑，當(dāng)它們與含核酸和蛋白質(zhì)的水溶液一同振搖時(shí)構(gòu)成乳狀液，蛋白質(zhì)因充分接觸酚和氯仿而變性，與核酸分開(kāi)。離心后可分為兩相，普通上層為含核酸的水相，下層為有機(jī)相，交界處是變性凝聚的蛋白質(zhì)層。最后利用乙醇或異丙醇將核酸沉淀離心搜集即可。蛋白質(zhì)的去除第三節(jié)分別純化從細(xì)胞中提獲得到的生物大分子往往是不純真的，含有大量雜質(zhì)，必需進(jìn)一步分別純化，這一階段可分為粗分級(jí)分別和細(xì)分級(jí)分別兩步進(jìn)展。一、粗提純

1.蛋白質(zhì)的粗提純主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(kāi)。這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便，處置量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低?！?〕鹽析向蛋白質(zhì)溶液中參與大量的中性鹽[〔NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀，這種景象稱(chēng)為鹽析。鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來(lái)溶液中大部分的自在水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子外表的水化層。不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子外表的極性基團(tuán)的種類(lèi)、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需求的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)理蛋白質(zhì)中鹽的濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出分段鹽析〔2〕等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液pH變化而變化。在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小。不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，因此經(jīng)過(guò)調(diào)理溶液pH到目的蛋白的等電點(diǎn)，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開(kāi)，從而除去大量雜蛋白?！?〕有機(jī)溶劑法與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。有機(jī)溶劑引起蛋白量變性的緣由有兩個(gè)：降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子外表可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。是極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，而使蛋白質(zhì)分子沉淀。室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。假設(shè)預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將其逐漸參與蛋白質(zhì)溶液中，防止有機(jī)溶劑部分濃度過(guò)高，那么在很大程度上處理變性問(wèn)題。不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需求的有機(jī)溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機(jī)溶劑分別不同的蛋白質(zhì)。

2.核酸的粗提純從細(xì)胞中提獲得到的核酸，常混雜有蛋白質(zhì)及各種大小的核酸同類(lèi)物等雜質(zhì)，可采用適當(dāng)方法進(jìn)展粗提純。粗提純中，進(jìn)一步將蛋白質(zhì)除去,可用去污劑或有機(jī)溶劑多次反復(fù)提取。從RNA除去混雜的DNA，可用DNAase將DNA降解掉。從DNA中除去混雜的RNA，可用RNAase將RNA降解掉。二、精提純1.蛋白質(zhì)精提純普通蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級(jí)后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進(jìn)一步提純，通常運(yùn)用高分辨率的柱層析及電泳方法。常用的柱層析方法有凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析。常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分別純化的方法之一，制備的結(jié)晶物經(jīng)常作為蛋白質(zhì)構(gòu)造分析之用。核酸樣品進(jìn)展精提純，普通常用超離心、電泳、柱層析等方法。超離心包括速度區(qū)帶離心、沉降平衡超離心。電泳包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖電泳。前者凝膠孔徑小，適宜分別1000個(gè)核苷酸以下的核酸分子。后者孔徑大，適宜分別較大的核酸分子。柱層析主要有凝膠過(guò)濾柱層析、離子交換層析、羥基磷灰石柱層析。2.核酸精提純?nèi)?、純度鑒定生物大分子經(jīng)過(guò)分別提純，最后還要鑒定制品的純度。蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉降分析法等。選用任何單獨(dú)一種鑒定方法都不能最后確定蛋白質(zhì)的純度，必需同時(shí)采用2-3種不同的方法才干確定。核酸的純度鑒定普通采用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳，沉降分析和紫外吸收法〔A260/A280〕等方法。同蛋白質(zhì)一樣，核酸純度鑒定也必需采用2-3種方法才干確定。第四節(jié)生物大分子的濃縮、枯燥及保管一、濃縮1.吸收法2.超濾法二、枯燥1.真空枯燥2.冷凍真空枯燥三、樣品的保管1.干態(tài)保管2.液態(tài)保管離心技術(shù)概論普通制備離心超離心技術(shù)第二章離心技術(shù)臺(tái)式高、超速離心機(jī)0.6-10萬(wàn)rpm離心機(jī)制備性分析性分析性超速離心機(jī)普通離心機(jī)冰凍離心機(jī)臺(tái)式〔或地面式〕普通離心機(jī)大容量冰凍離心機(jī)小于0.6萬(wàn)rpm高速冰凍離心機(jī)0.6-2.5萬(wàn)超速冰凍離心機(jī)2.5-8萬(wàn)或更高(分析性超速離心主要用于檢測(cè)大分子物質(zhì)的沉降特征和構(gòu)造等)概述普通制備離心普通制備離心是指在分別、濃縮、提純樣品中，不用制備密度梯度的一次完成的離心操作，實(shí)驗(yàn)室用低、高速離心機(jī)可運(yùn)用于此項(xiàng)技術(shù)。臺(tái)式或地面式普通離心機(jī)高速冰凍離心機(jī)科研人員將采集的臍帶血放置到低溫超速離心機(jī)內(nèi)進(jìn)展技術(shù)處置③超速冰凍離心機(jī)運(yùn)用范圍：

■病毒及亞細(xì)胞組份分別

■蛋白梯度分別

■脂蛋白分別

■RNA梯度沉淀

■質(zhì)粒DNA提純

制備性超速離心主要利用離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時(shí)所產(chǎn)生的強(qiáng)大離心力，加快顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)或浮力密度差的物質(zhì)分開(kāi)。沉降系數(shù)指單位(cm)離心場(chǎng)中顆粒沉降的速度，用s表示，其單位是1×10-13秒，簡(jiǎn)稱(chēng)S，即1S＝1×10-13秒。沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的間隔。制備超離心的關(guān)鍵是如何根據(jù)顆粒和介質(zhì)的性質(zhì)以及轉(zhuǎn)子的某些參數(shù)來(lái)確定轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間。顆粒沉降的時(shí)間和速度取決于：離心力、顆粒的大小外形和密度、沉降介質(zhì)的密度和粘度。超離心技術(shù)一、原理和計(jì)算二、轉(zhuǎn)子離心管及選擇三、離心技術(shù)類(lèi)型四、梯度回收一、原理和計(jì)算〔一〕離心力和相對(duì)離心力當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)頭以一定的角速度w〔弧度/秒〕旋轉(zhuǎn)，顆粒的旋轉(zhuǎn)半徑為r〔厘米〕時(shí)，任何顆粒均受一個(gè)向外的離心力，此離心力為：F=mω2r①式中，F(xiàn)通常以地心引力表示，稱(chēng)為相對(duì)離心力〔RCF〕，相對(duì)離心力指在離心力場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度g〔980厘米/秒2〕，這時(shí)RCF可表示如下：RCF=ω2r/980②實(shí)踐上，這一關(guān)系式常用每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)n〔或rpm〕，以更通用表達(dá)式來(lái)表示，由于ω=2πn/60于是：RCF=4π2〔rpm〕2r/3600*980③簡(jiǎn)化得：RCF=1.119×10-5〔rpm〕2r④普通低轉(zhuǎn)速時(shí)常用rpm來(lái)表示，高轉(zhuǎn)速離心那么以g表示。半徑相對(duì)離心力轉(zhuǎn)速方法：三點(diǎn)一線(xiàn)，左對(duì)左，右對(duì)右為了便于進(jìn)展轉(zhuǎn)速和相對(duì)離心力之間的換算，人們?cè)谑舰鄣母咨现圃炝巳哧P(guān)系的列線(xiàn)計(jì)算圖RCF=1.119×10-5〔rpm〕2r二、轉(zhuǎn)子離心管及選擇〔一〕離心管常見(jiàn)的玻璃離心管質(zhì)硬且脆，不能接受超離心的壓力。用于超離心機(jī)轉(zhuǎn)子中的離心管分為塑料管及不銹鋼管兩類(lèi)。離心時(shí)樣品普通應(yīng)裝滿(mǎn)離心管，否那么將能夠因有氣泡而使管的外部受壓不均，呵斥離心管破裂，使轉(zhuǎn)子不平衡產(chǎn)惹事故?！捕畴x心管帽超離心機(jī)所用離心管普通都附有管帽，離心時(shí)離心管需戴上管帽?！踩侈D(zhuǎn)子及選擇主要有角轉(zhuǎn)子、程度轉(zhuǎn)子、垂直轉(zhuǎn)子、區(qū)帶轉(zhuǎn)子等幾種類(lèi)型。1、角轉(zhuǎn)子指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子，角度越大，沉降越結(jié)實(shí)，分別效果越好，相反，角度越小，顆粒沉降間隔短，沉降速度快，但分別效果差。顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時(shí)，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)會(huì)出現(xiàn)顆粒堆積，稱(chēng)為“壁效應(yīng)〞。最適宜差速離心，強(qiáng)度大、方便，但加速或減速時(shí)，對(duì)樣品有攪動(dòng)。2、程度轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)子活動(dòng)管套內(nèi)的離心管，旋轉(zhuǎn)時(shí)隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)，從垂直懸吊上升到程度位置〔約200－800rpm〕時(shí)。顆粒在程度轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子方向的，梯度離心中顆粒沉降區(qū)帶橫過(guò)離心管，離心后區(qū)帶不用重新定位，但只需處于樣品區(qū)帶中心的顆粒才直接向管底沉降，其它顆粒那么撞向壁的兩側(cè)，產(chǎn)生“壁效應(yīng)〞，但受振動(dòng)和變速攪亂后對(duì)流景象小得多。3、垂直轉(zhuǎn)子角式轉(zhuǎn)子的特殊方式，主要用于等密度梯度離心，這種轉(zhuǎn)子顆粒挪動(dòng)間隔短，比程度式和角式轉(zhuǎn)子節(jié)約大量時(shí)間，但速度劇變?nèi)菀桩a(chǎn)生對(duì)流擾亂。4、區(qū)帶轉(zhuǎn)子

三、離心技術(shù)類(lèi)型常用離心技術(shù)普通包括差速離心法，速度區(qū)帶法和等密度梯度沉降法?！惨弧巢钏匐x心法原理：采用逐漸添加離心速度或低速和高速交替進(jìn)展離心，使沉降速度不同的顆粒在不同的分別速度及不同的離心時(shí)間下分批分別的方法，稱(chēng)為差速離心法。當(dāng)以一定離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)展離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)展離心，又得到第二部分較大、較重顆粒的“沉淀〞及含小和輕顆粒“上清液〞，如此多次離心處置，即能把液體中的不同顆粒較好分開(kāi)。這時(shí)所得沉淀是不純的，需經(jīng)再懸浮和再離心〔2－3次〕，才干得到較純顆粒。用于分別不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線(xiàn)粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。已破碎的細(xì)胞沉淀〔細(xì)胞核〕上清液沉淀〔細(xì)胞膜碎片、線(xiàn)粒體、溶酶體〕上清液沉淀〔核糖核蛋白體〕上清液〔可溶性組分〕500g，1010000g，10100000g，3h〔二〕速度區(qū)帶法速度區(qū)帶主要用于分別密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分別生物顆粒的最小密度。生物顆?！布?xì)胞或細(xì)器〕在非常平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而到達(dá)分別?！踩车让芏忍荻瘸两捣ㄔ恚旱让芏忍荻瘸两怠瞚sopycnicsedimentation〕適用于分別密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在延續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長(zhǎng)時(shí)間那么沉降或漂浮到與本身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里到達(dá)平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分別。等密度梯度離心普通常用CsCl、RuCl、蔗糖、甘油等做介質(zhì)。介質(zhì)梯度不需預(yù)先制備，離心時(shí)把密度均一的介質(zhì)液和樣品混合后裝入離心管，經(jīng)過(guò)離心構(gòu)成梯度，讓顆粒在梯度中進(jìn)展再分配。常用來(lái)分別提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。四、梯度回收1、穿刺法這是一種簡(jiǎn)易的手工操作法，采用針穿刺離心管底部，使梯度靠重力自在滴出，然后依次作分布搜集，此法適用于薄壁塑料管，流出液部分搜集于小試管中，經(jīng)分析決議取舍或合并。此法對(duì)梯度擾動(dòng)小，但離心管不能再用，不適宜回收管底有沉淀的梯度，也不運(yùn)用于不銹鋼或厚壁塑料管。2、取代法回收梯度中最常運(yùn)用的一種方法，分為向上及向下取代兩種。取代法優(yōu)點(diǎn)是不破壞離心管，能用于較粘梯度，可借光學(xué)〔放射性〕系統(tǒng)進(jìn)展流出液跟蹤，簡(jiǎn)化分析化驗(yàn)任務(wù)。缺陷是開(kāi)場(chǎng)取代操作時(shí)易引起擾亂，操作需特別小心，梯度粘度太大時(shí)也不適宜。

濃取代液稀濃通入空氣、輕液體搜集濃稀搜集3、虹吸法用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯度，它也不損傷離心管，尤其適用于不銹鋼管中物質(zhì)的分級(jí)分別，但虹吸時(shí)易引起分別區(qū)帶擾亂，最好運(yùn)用專(zhuān)門(mén)的安裝。

除取代法和虹吸法外，有時(shí)從管上部直接仔細(xì)地用注射器或吸管定量移出梯度液，效果也較好。4、切割法適用于極粘梯度，就是用離心管切割器將凍結(jié)的塑料管切成薄片，從而將梯度分部搜集，此法僅適用于賽璐璐或硝酸纖維素管。梯度的分析分析梯度中的回收物質(zhì)常用紫外吸收法、酶活力測(cè)定法、放射標(biāo)志法。蛋白質(zhì)、核酸或某些含蛋白質(zhì)、核酸占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞器、病毒可用紫外吸收法測(cè)定。細(xì)胞器普通可測(cè)定標(biāo)志酶活性，通常每一組分至少選二種標(biāo)志酶，如一時(shí)找不到更好的測(cè)定目的物，也可測(cè)光吸收來(lái)推斷分布的組分，對(duì)于同位素標(biāo)志物，最好是測(cè)定其放射活性。此外，某些情況下也可用免疫法，電泳法測(cè)定物質(zhì)在梯度中的分布，亞細(xì)胞成分可用電鏡或光學(xué)顯微鏡察看分析各分部的組分，最后分析結(jié)果。第三章層析技術(shù)引言層析法的根本原理層析法的分類(lèi)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析〔HPLC〕引言層析法也稱(chēng)色譜法，是1906年俄國(guó)植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素經(jīng)過(guò)裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后構(gòu)成不同的色帶而被分開(kāi)，由此得名為“色譜法〞〔Chromatography)。后來(lái)無(wú)色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分別。1944年出現(xiàn)紙層析。以后層析法不斷開(kāi)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析法的根本原理層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別〔如吸附力、分子外形及大小、分子親和力、分配系數(shù)等〕，使各組分在兩相〔一相為固定的，稱(chēng)為固定相；另一相流過(guò)固定相，稱(chēng)為流動(dòng)相〕中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度挪動(dòng)而到達(dá)分別的目的。層析法的分類(lèi)按兩相所處的形狀分類(lèi)：流動(dòng)相有兩種形狀：*液體作為流動(dòng)相*氣體作為流動(dòng)相固定相也有兩種形狀：*固體吸附劑作為固定相*以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的形狀分為：液相層析液-固層析液-液層析氣相層析氣-固層析氣-液層析按層析過(guò)程的機(jī)理分類(lèi)：吸附層析：利用吸附劑外表對(duì)不同組分吸附性能的差別，到達(dá)分別鑒定的目的。分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分別。離子交換層析：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。按操作方式不同分類(lèi)：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向挪動(dòng)而到達(dá)分別。紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，以到達(dá)分別鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類(lèi)似的方法進(jìn)展物質(zhì)的分別和鑒定。第一節(jié)吸附層析技術(shù)一、根本原理吸附層析法〔液-固層析法，LSC〕原理：利用固定相的固體吸附劑外表對(duì)不同組分吸附力的大小及洗脫液對(duì)它的溶解作用〔解吸作用〕的差別進(jìn)展分別。特點(diǎn)：適宜分別不同種類(lèi)的化合物(醇類(lèi)和芳香烴〕。二、吸附劑吸附劑是具有大外表積的活性多孔固體，與待分別物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等羥基羥基磷灰石〔HA〕[Ca10(PO4)6.(OH)2],可用于分別蛋白質(zhì)與核酸。其外表有Ca2+和PO43-兩種帶電基團(tuán)；酸性和中性蛋白質(zhì)可與Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與PO43-結(jié)合。HA柱層析最重要的用途之一是分別單鏈DNA和雙鏈DNA，由于它對(duì)雙鏈DNA的親和力大于單鏈DNA。第二節(jié)分配層析技術(shù)分配層析法〔液-液層析法，LLC〕原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相〔固定相和流動(dòng)相〕之間的分配系數(shù)的不同而到達(dá)分別各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體外表，流動(dòng)相流過(guò)固定相。分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在固定相和流動(dòng)相兩相內(nèi)的濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱(chēng)為分配系數(shù)。K=c1/c2分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分配的數(shù)量多，挪動(dòng)快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，挪動(dòng)慢。因此可彼此分開(kāi)。特點(diǎn)：液-液層析法適宜于分別同系物或同分異構(gòu)體ABCDE3216168168441212228128層析柱分別物質(zhì)的表示圖：固定相為固體顆粒，裝在層析柱內(nèi)，高5cm，固定相周?chē)湟缫后w流動(dòng)相，每厘米柱中液相體積為1cm3。假設(shè)在柱頂參與1cm3溶劑,其中含32mg樣品，同時(shí)應(yīng)有一樣體積的溶劑從柱底流出，此時(shí)樣品處于柱中A位置。假設(shè)樣品的分配系數(shù)是1，那么它在固相與液相間等量分配。假設(shè)再有1cm3的溶劑加到柱上，A部分中的溶劑帶著16mg的物質(zhì)向下挪動(dòng)到B，A和B中的物質(zhì)都將發(fā)生再分配，不同組分的含量不同組分在柱中的位置上部中部下部不同物質(zhì)分配系數(shù)不同時(shí)：第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)一、根本原理概念〔排阻層析，分子篩層析〕：當(dāng)生物大分子經(jīng)過(guò)裝有凝膠顆粒的層析柱時(shí)，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)展分別的技術(shù)。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀構(gòu)造，被分別的混合物流過(guò)層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下挪動(dòng)，并最先被洗脫出來(lái)；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自在出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過(guò)的路程較長(zhǎng)挪動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來(lái)。二、凝膠的種類(lèi)和性質(zhì)1.交聯(lián)葡聚糖凝膠〔Sephadex)1)SephadexGG后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。G反響凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。2〕SephadexLH-20，是SephadexG-25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分別不溶于水的物質(zhì)。2.瓊脂糖凝膠〔Sepharose;pharmacia;Bio-Gel)依托糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀構(gòu)造，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀構(gòu)造越密集。3.聚丙烯酰胺凝膠一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。商品名為生物膠-P〔Bio-GelP)。4.聚苯乙烯凝膠〔Styrogel)大網(wǎng)孔構(gòu)造。三、凝膠過(guò)濾在實(shí)驗(yàn)室中的運(yùn)用1〕生物大分子物質(zhì)的分別純化2〕分子量的測(cè)定3〕分級(jí)分別4〕溶液濃縮5〕平衡常數(shù)的測(cè)定6〕細(xì)胞及顆粒的分別LogMABCLogM測(cè)V測(cè)蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān)，LogM=〔k1-k2〕Ve〔Ve為洗脫體積〕先測(cè)得幾種規(guī)范蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得不斷線(xiàn)，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，查規(guī)范曲線(xiàn)即可確定分子量。原理:根據(jù)離子交換樹(shù)脂對(duì)需求分別的各種離子的親和力不同而到達(dá)分別的目的。將離子交換樹(shù)脂裝入層析柱。離子交換樹(shù)脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團(tuán)。含有酸性可解離基團(tuán)的稱(chēng)為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，可解離出H+，含有堿性可解離基團(tuán)的稱(chēng)為陰離子交換樹(shù)脂，可解離出OH-。第四節(jié)離子交換層析法離子交換層析的根本原理++++++———++++++假設(shè)選擇陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，那么帶正電荷的物質(zhì)與H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。假設(shè)選擇陰離子交換樹(shù)脂，那么帶負(fù)電荷的物質(zhì)可與OH-發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。物質(zhì)在樹(shù)脂上結(jié)合的結(jié)實(shí)程度即親和力大小有差別，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個(gè)洗脫下來(lái)，到達(dá)分別純化的目的。++原理：利用生物大分子間特異的親和才干來(lái)純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補(bǔ)的DNA等。將待純化物質(zhì)的特異配體經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反響共價(jià)的銜接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)那么不被吸附，經(jīng)過(guò)洗脫雜質(zhì)即可除去。被結(jié)合的物質(zhì)再用含游離的相應(yīng)配體溶液把它從柱上洗脫下來(lái)。第五節(jié)親和層析法+CC配基蛋白質(zhì)1.配基固相化2.親和吸附固體載體3.解吸附C第六節(jié)高壓液相層析〔HPLC〕特點(diǎn)：①運(yùn)用的固相支持劑顆粒很細(xì)，外表積很大,因此分辨率很高。②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。許多類(lèi)型的柱層析都可用HPLC來(lái)替代，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過(guò)濾等。第四章電泳技術(shù)引言第一節(jié)電泳的根本原理第二節(jié)聚丙烯酰胺凝膠電泳第三節(jié)瓊脂糖凝膠電泳第四節(jié)免疫電泳一、概述二、聚丙烯酰胺凝膠的制備三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系四、不延續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳引言電泳的概念：帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向相反電極挪動(dòng)的景象稱(chēng)為電泳〔electrophoresis〕。電泳景象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)〔1808年俄國(guó)物理學(xué)家Re?ss進(jìn)展了世界上第一次電泳實(shí)驗(yàn)〕。但電泳技術(shù)的廣泛運(yùn)用，那么是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)勝利地進(jìn)展紙電泳以后，特別是近幾十年以來(lái)，電泳技術(shù)開(kāi)展很快，各種類(lèi)型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛運(yùn)用。按電泳的原理來(lái)分，可分為二類(lèi)：⒈自在界面電泳：又稱(chēng)挪動(dòng)界面電泳，是指在沒(méi)有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)展的電泳。其安裝復(fù)雜，價(jià)錢(qián)昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推行運(yùn)用。⒉區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分別物質(zhì)在支持介質(zhì)上分別成假設(shè)干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過(guò)程中的對(duì)流和分散，以使被分別的成分得到最大分辨率的分別。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差別，又可分為不同的類(lèi)型。電泳的分類(lèi)引言按支持介質(zhì)種類(lèi)的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤(pán)球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保管照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類(lèi)型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒(méi)有分子篩效應(yīng)，主要靠被分別物的電荷多少進(jìn)展分別。引言③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析〔一板多測(cè)〕。天然淀粉經(jīng)加工處置即可運(yùn)用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號(hào)之間的質(zhì)量相差很大，很難得到反復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長(zhǎng)，操作費(fèi)事，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少運(yùn)用。④瓊脂糖凝膠電泳：普通用于核酸的分別分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只需很小的分子篩效應(yīng)。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分別、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)引言第一節(jié)電泳的根本原理電泳是在電場(chǎng)的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運(yùn)動(dòng)，不同的物質(zhì)在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，由于所帶電荷不同，向相反電極泳動(dòng)速度不同進(jìn)而到達(dá)分別目的。

.電泳的根本原理在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷〔種類(lèi)和數(shù)量〕、大小和外形，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谝粯与妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而構(gòu)成嚴(yán)密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)展分別、分析和鑒定的根本原理。

+-假設(shè)將帶凈電荷Q的粒子放入電場(chǎng)，那么該粒子所遭到的電荷引力為：F引=E·Q〔1〕在溶液中,運(yùn)動(dòng)粒子與溶液之間存在阻力F阻F阻=6πrηV當(dāng)F引=F阻時(shí)EQ=6πrηV

V=由上式可以看出,粒子的挪動(dòng)速度(泳動(dòng)速度V)與電場(chǎng)強(qiáng)度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度(η)成反比。非球形分子〔如線(xiàn)狀DNA〕在電泳過(guò)程中遭到更大的阻力，即粒子的泳動(dòng)速度與粒子外形也有關(guān)。EQ6πrη〔2〕〔3〕〔4〕電泳的根本原理由〔4〕可知，帶電粒子的泳動(dòng)速度受電場(chǎng)強(qiáng)度影響，使得同一種帶電粒子在不同電場(chǎng)里泳動(dòng)速度不同，為了便于比較，常用遷移率m〔或稱(chēng)泳動(dòng)度，指帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度〕替代泳動(dòng)速度表示粒子的泳動(dòng)情況。m=V/E=Q/6πrη〔5〕由上式可以看出，遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量，粒子大小及溶液粘度有關(guān)而與電場(chǎng)強(qiáng)度無(wú)關(guān)。EQ6πrη〔4〕V=電泳的根本原理由于蛋白質(zhì)、氨基酸等的電離度α隨溶液pH變化而不同，所以實(shí)踐上常運(yùn)用有效遷移率。有效遷移率U為遷移率m和當(dāng)時(shí)條件下電離度α的乘積。U=m·α〔6〕將〔6〕式代入〔5〕式得：U=〔7〕.Qα.6πrη由〔7〕式可以看出，凡能影響溶液粘度η的要素如溫度，影響分子帶電量Q及解離度α的要素如pH的改動(dòng)，都會(huì)對(duì)有效遷移率，產(chǎn)生影響。電泳的根本原理

以上討論的是在溶液中進(jìn)展的自在界面電泳的情況，在用支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響要素外，有效遷移率還受電滲〔是指在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)挪動(dòng)〕的影響。電泳時(shí)應(yīng)防止用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。最后要思索選用離子強(qiáng)度適宜的溶液。離子強(qiáng)度影響粒子的電動(dòng)電勢(shì)，溶液的離子強(qiáng)度越高，由于溶液中的離子會(huì)分擔(dān)大部分電流，那么粒子的電動(dòng)電勢(shì)越小，泳動(dòng)速度越慢；反之越快。總之，電泳受粒子本身大小、外形、所帶電量、溶液粘度、溫度、pH、電滲及離子強(qiáng)度多種要素的影響。

電泳的根本原理第二節(jié)聚丙烯酰胺凝膠電泳一、概述聚丙烯酰胺凝膠電泳〔polyacrylamidegelelectropho-resis，PAGE〕是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化小，沒(méi)有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體〔acry-lamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr〕和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺〔methylanebisacrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Bis〕在催化劑作用下合成的。CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N′-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺二、聚丙烯酰胺凝膠的制備聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：1.化學(xué)聚合化學(xué)聚合的催化劑通常采用過(guò)硫酸銨，此外還需求加速劑TEMED〔N，N，N′，N′-四甲基乙二胺〕，它能以自在基的方式存在。微量TEMED的參與，可使過(guò)硫酸銨構(gòu)成氧自在基，這些自在基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺單體構(gòu)成自在基，