造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者的HLA基因分型課件

造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者血樣的

HLA基因定型及資料錄入

鄧志輝

深圳市輸血醫(yī)學(xué)研究所

2005年5月16日主要工作流程一、各“工作站”將審核、遴選合格的造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者血樣（貼有骨髓條碼），以及捐獻(xiàn)者樣本清單（捐獻(xiàn)者姓名及骨髓編號(hào)），一并送達(dá)我研究所免疫遺傳實(shí)驗(yàn)室；二、免疫遺傳實(shí)驗(yàn)室對(duì)捐獻(xiàn)者血樣進(jìn)行HLA-A、B和DRB1基因定型，對(duì)送檢血樣的HLA基因定型結(jié)果負(fù)責(zé)；

三、出具“捐獻(xiàn)者HLA基因分型檢測(cè)結(jié)果”報(bào)告。主要內(nèi)容（1）捐獻(xiàn)者HLA基因定型血樣的運(yùn)輸（2）HLA相關(guān)基本概念（3）HLA分型（定型）技術(shù)HLA血清學(xué)分型技術(shù)HLA基因分型技術(shù)捐獻(xiàn)者HLA基因定型血樣的運(yùn)輸注意事項(xiàng)：1、因“登記表”中填寫的內(nèi)容審核不合格血樣、以及經(jīng)HBV等化驗(yàn)檢查健康不合格的血樣，予以剔除；2、檢查血樣管有無(wú)破管；3、路途遠(yuǎn)、條件許可，可放置適量干冰；4、由專人運(yùn)送，防震、防顛覆；5、合格的HLA基因定型血樣與捐獻(xiàn)者樣本清單一并送往組織配型實(shí)驗(yàn)室。人類白細(xì)胞抗原(HumanLeucocyteAntigen,HLA)1958年，Dausset采用白細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)出第一個(gè)人類白細(xì)胞抗原Mac（A2）。為高度復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，每個(gè)人的HLA千差萬(wàn)別，即人體生物學(xué)的“身份證”，不同的民族、同一民族不同的地域，HLA基因及單倍型分布有其特點(diǎn)，HLA為人類主要組織相容性系統(tǒng)（MHC），與移植排斥反應(yīng)密切相關(guān)，又稱移植抗原。是機(jī)體“識(shí)別自身”、“排除異已”的主要遺傳標(biāo)記，參與免疫應(yīng)答反應(yīng)。HLA基因家族位于人類第6號(hào)染色體短臂，全長(zhǎng)3.6Mb，HLA基因家族是迄今為止最復(fù)雜、多態(tài)性最豐富、免疫功能相關(guān)基因最集中、與疾病關(guān)聯(lián)最密切的一個(gè)區(qū)域。HLA抗原的分類HLA-I類：由一條具有多態(tài)性的α多肽鏈和一條沒有多態(tài)性的

2微球蛋白通過(guò)非共價(jià)鍵組成異二聚體。經(jīng)典HLA-I類抗原：包括HLA-A、B、C位點(diǎn)抗原，分布于幾乎所有有核細(xì)胞表面上。如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等，血小板上吸附HLA-A、B抗原。非經(jīng)典HLA-I類抗原：包括HLA-E、G、F位點(diǎn)抗原，抗原在特定時(shí)間選擇性分布。HLA-II類：由34KD的

鏈和29KD的β鏈以非共價(jià)鍵連接而成，包括HLA-DR、DP、DQ抗原；僅分布于B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等少數(shù)細(xì)胞表面。HLA-Ⅲ類：主要包括補(bǔ)體分子C2、C4及Bf等。HLA基因定位于人類第6號(hào)染色體短臂（6p21.31），全長(zhǎng)3.6Mb，占人類基因組堿基數(shù)的0.1%。HLA-I類基因：有10個(gè)遺傳座位，靠近染色體頂端，HLA-A、B、C、E、G、F為表達(dá)基因，H、J、K、L為假基因，無(wú)基因產(chǎn)物。

HLA-Ⅱ類基因：靠近染色體著絲粒端，主要包括HLA-DR、DP、DQ基因座。HLA基因結(jié)構(gòu)體細(xì)胞為二倍體，同源染色體之間相互配對(duì)，每一HLA位點(diǎn)有2個(gè)等位基因，一個(gè)來(lái)自于母親，另一個(gè)來(lái)自于父親。檢測(cè)HLA-A、B和DRB1三個(gè)位點(diǎn)，有6個(gè)等位基因，即6個(gè)HLA分型數(shù)據(jù)。檢出的HLA抗原及等位基因2003年世界衛(wèi)生組織（WHO）HLA因子命名委員會(huì)命名的HLA等位基因：HLA座位等位基因特異性HLA-A25024HLA-B49049HLA-Cw11913HLA-DRB131517HLA-DPB1996HLA-DQB1537HLA系統(tǒng)等位基因豐富，每個(gè)人的等位基因型千差萬(wàn)別，可以說(shuō)在隨機(jī)人群中，難以有完全相同的。HLA的命名1、血清學(xué)命名：遺傳位點(diǎn)后用數(shù)字表示，如A1、A2、A3、B5等。

以大寫字母A、B、C…表示HLA的遺傳座位；HLA特異性以數(shù)字表示；除HLA-A、B位點(diǎn)抗原的特異性的命名數(shù)字不重復(fù)外，其它位點(diǎn)抗原連續(xù)獨(dú)立命名；C位點(diǎn)抗原以Cw為字首命名，以和補(bǔ)體系統(tǒng)區(qū)別。2、HLA等位基因命名原則：位點(diǎn)后加“*”，再加數(shù)字表示。如DRB4*0103102N第1、2位數(shù)表示HLA抗原的特異性，第3、4位數(shù)表示等位基因（亞型），結(jié)尾加N表示無(wú)效等位基因或不表達(dá)基因。HLA等位基因所對(duì)應(yīng)的血清學(xué)特異性，可查閱過(guò)WHO公布的HLA字典。

HLA低分辨水平基因定型：確定HLA基因前2位數(shù)。HLA高分辨水平基因定型：確定HLA基因第4位以后的數(shù)字。HLA的生物學(xué)功能HLA參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，與抗原肽結(jié)合形成HLA-抗原肽復(fù)合物，抗原提呈細(xì)胞將此復(fù)合物交由T淋巴細(xì)胞處理，T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體（TCR）能夠?qū)乖岢始?xì)胞上的HLA-抗原肽復(fù)合物產(chǎn)生雙識(shí)別，從而介導(dǎo)免疫反應(yīng)。T細(xì)胞受體對(duì)HLA-抗原肽復(fù)合物的

雙識(shí)別作用人類白細(xì)胞抗原（HLA）的應(yīng)用HLA分型在骨髓和器官移植組織型法醫(yī)學(xué)親子鑒定和個(gè)體識(shí)別人類種群學(xué)安全輸血疾病相關(guān)聯(lián)的研究等領(lǐng)域（如HLA-B27）HLA分型技術(shù)1、傳統(tǒng)的血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)分型方法

因需要有活性的細(xì)胞、定型血清或分型細(xì)胞來(lái)源困難、分型準(zhǔn)確性較差等原因，已逐步被淘汰。2、PCR為基礎(chǔ)的HLA基因分型技術(shù)分型所需要的血樣量少，不需要有活性的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、結(jié)果的準(zhǔn)確性高，易于質(zhì)控和準(zhǔn)標(biāo)化。HLA基因分型技術(shù)取代了血清學(xué)方法。當(dāng)前的“中國(guó)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(kù)”的建庫(kù)技術(shù)，不同于以往的“中華骨髓庫(kù)”。前者采用基因定型技術(shù)檢測(cè)HLA-A、B、DRB1基因，后者采用血清學(xué)方法檢測(cè)HLA-A、B抗原?！爸袊?guó)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(kù)”對(duì)捐獻(xiàn)者血樣HLA基因分型技術(shù)的要求對(duì)HLA-A、B和DRB1進(jìn)行基因分型，分辨率達(dá)低分辨水平。結(jié)果既報(bào)告每一樣本的基因型，同時(shí)報(bào)告對(duì)應(yīng)的特異性。通過(guò)各省級(jí)組織配型實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控，以及國(guó)家“HLA質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室”組織的室間質(zhì)控對(duì)HLA基因分型的準(zhǔn)確性進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。HLA基因分型技術(shù)PCR-序列特異性引物（PCR-SSP）PCR-SSO流式磁珠分析HLA測(cè)序分型（SBT）PCR-序列特異性寡核苷酸探針（PCR-SSOP）基因芯片技術(shù)參比鏈介導(dǎo)的構(gòu)象分析(RSCA)

HLA單倍體基因測(cè)序HLA基因分型的步驟

1、DNA提取2、PCR擴(kuò)增3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)4、結(jié)果分析（判別受檢者HLA基因型）5、HLA基因定型報(bào)告

PCR-序列特異性引物（PCR-SSP）分型技術(shù)

基本原理：

使用序列特異性引物（SSP）特異性擴(kuò)增HLA等位基因，電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)是否存在PCR產(chǎn)物以及片段大小，確定相應(yīng)基因。主要步驟：1、DNA提取2、PCR擴(kuò)增3、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)4、結(jié)果分析PCR-序列特異性引物（PCR-SSP）分型技術(shù)PCR-序列特異性引物

（PCR-SSP）分型技術(shù)特點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、直觀等，特別適合于尸腎移植的組織配型；所需設(shè)備簡(jiǎn)單，易于開展；為常規(guī)采用的經(jīng)典HLA基因分型技術(shù)。應(yīng)用：適合于經(jīng)典HLA-Ⅰ、Ⅱ類分子的基因分型分辨率：低分辯、高分辯基因分型水平。PCR-SSO流式磁珠分析技術(shù)

基本原理：以反向核酸雜交為基礎(chǔ)，雜交產(chǎn)物采用流式磁珠儀進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，為高通量HLA基因定型技術(shù)。PCR-SSO流式磁珠分析技術(shù)的特點(diǎn)（一）實(shí)驗(yàn)原理、引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)等，與SSP分型技術(shù)不同。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將標(biāo)記探針的磁珠直接加入PCR產(chǎn)物中，微量離心管（反應(yīng)板）置于PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行分子雜交；雜交產(chǎn)物用流式磁珠儀進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣檢測(cè)，用HLA分析軟件確定HLA基因型。

流式磁珠分析技術(shù)的特點(diǎn)（二）配合DNA全自動(dòng)DNA提取儀及多個(gè)PCR基因擴(kuò)增儀，具有高通量、操作簡(jiǎn)便、快速特點(diǎn)。適合骨髓庫(kù)、臍血庫(kù)大批量樣本的HLA基因分型工作?；诹魇酱胖榉治黾夹g(shù)，已有多家商品化、低分辯水平的HLA基因分型試劑盒?？捎糜贖LA-A、B、C、DRB1和DQB1座位的基因分型。HLA測(cè)序分型（SBT）技術(shù)HLA-座位檢測(cè)對(duì)象HLA-A第2，3，4外顯子的正、反向序列HLA-B第2，3，4外顯子的正、反向序列HLA-Cw第2，3外顯子正、反向序列HLA-DRB1第2外顯子正、反向序列，Condon86反向序列。HLA-DQB1第2外顯子正、反向序列，第3外顯子的反向測(cè)序。若存在DQB1*0201/0202或0301/0309，分析第3外顯子的測(cè)序結(jié)果。HLA測(cè)序分型（SBT）技術(shù)國(guó)際公認(rèn)的HLA基因分型方法，高分辨率、高精度；HLA測(cè)序分型技術(shù)較復(fù)雜，受實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件、試劑價(jià)格的限制，以往能夠開展HLA測(cè)序分型的實(shí)驗(yàn)室尚不多；隨著非血緣關(guān)系造血干細(xì)胞移植供/受者對(duì)HLA高分辯確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，以及人類學(xué)研究、HLA與疾病相關(guān)聯(lián)等領(lǐng)域的需要，SBT技術(shù)的開展已日益增多。HLA測(cè)序分型（SBT）技術(shù)可在同一PCR反應(yīng)條件、同一測(cè)序反應(yīng)的條件下，對(duì)不同HLA座位進(jìn)行同步擴(kuò)增，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作；隨著毛細(xì)管電泳基因測(cè)