項目一動物組織中核酸的提取與鑒定課件

動物組織中核酸的提取與鑒定項目一一、實驗?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)和掌握用鹽溶法從動物組織提取核酸的原理和操作技術(shù)。了解定性鑒定核酸的原理和方法。

二、實驗原理

根據(jù)核糖核蛋白與脫氧核糖核蛋白在一定濃度的氯化鈉溶液中的溶解度不同進(jìn)行分離，然后用蛋白質(zhì)變性沉淀劑去除蛋白，使核酸釋放出來，再利用核酸不溶于乙醇的性質(zhì)將核酸析出，達(dá)到分離提純的目的。

三、實驗材料

試劑地衣酚（orcinol）試劑：稱取100mg地衣酚溶于100ml濃鹽酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O，該溶液應(yīng)在使用前新鮮配制。二苯胺試劑：稱取1g二苯胺（經(jīng)重結(jié)晶）溶入100ml冰醋酸中，再加入2.75ml濃H2SO4搖勻，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

三、實驗材料

試劑0.14mol/L氯化鈉溶液（內(nèi)含0.01mol/L檸檬酸），250ml；1mol/L氯化鈉溶液，250ml；95%乙醇（冷）；氯仿；異戊醇。

三、實驗材料

實驗器材

冷凍離心機(jī)（3000rpm）；組織搗碎機(jī)或組織勻漿器；不銹鋼剪刀；冰??；試管、試管夾；量筒、吸管；帶塞比色管、帶塞離心管。玻棒、燒杯；電爐等。

四、實驗方法

2.核酸的抽提

DNA的抽提將抽提1h的1mol/LNaCl勻漿懸液以3000rpm離心20min，棄去沉淀，將其上清液倒入帶塞的離心管中，加入等體積的氯仿及1/40體積的異戊醇振搖30min，離心20min。將其上清液加入2倍體積的冷95%乙醇，邊加邊搖，抽出玻棒，纖維狀DNA就纏繞在玻棒上待定性。

每次都需采用冷凍離心。

四、實驗方法

3.定性試驗RNA的呈色反應(yīng)

取2支干凈試管，一管加入1.5mlRNA溶液，另一管加入蒸餾水1.5ml，向兩管中加入3ml地衣酚試劑，于沸水中加熱10min，由黃色變?yōu)榫G色為陽性反應(yīng)。

DNA的呈色反應(yīng)取2支干凈試管，一管加入1.5mlDNA溶液，另一管加入蒸餾水1.5ml，向兩管中加入3ml二苯胺試劑，于沸水中加熱10min，由乳白色變?yōu)樗{(lán)色為陽性反應(yīng)。

五、注意事項在提取分離純化核酸時，為了保持核酸的完整性，防止核酸變性降解，操作時必須防止過酸或過堿。全部過程應(yīng)在低溫下(0℃左右)進(jìn)行，必要時還需加入抑制劑，以抑制核酸酶的作用。加氯仿、異戊醇后振搖要充分，但又不能太劇烈，以防DNA斷裂。要學(xué)會正確使用離心機(jī)，離心后，注意上清液和沉淀的取舍。六、項目總結(jié)及練習(xí)1.從動物組織（豬肝）中提取核酸，第一步是破碎肝臟組織細(xì)胞，請問破碎動物細(xì)胞的物理方法主要有哪些？（列舉5種）①研磨法；②組織勻漿法；③滲透壓變動法；④超聲波處理法；⑤反復(fù)凍融法等。六、項目總結(jié)及練習(xí)2.為什么在0.14mol/LNaCl溶液中要加0.01mol/L的檸檬酸，或者說，檸檬酸或檸檬酸鈉的作用是什么？與檸檬酸作用相同的物質(zhì)還有哪些？（最少1種）在核酸提取過程中要防止核酸降解。DNA酶可降解DNA，但DNA酶的活性需要Mg2+、Ca2+等金屬二價離子的激活，檸檬酸或檸檬酸鈉能螯合這些金屬二價離子，從而抑制DNA酶的活性。與檸檬酸作用相同的物質(zhì)還有EDTA、TA等，它們都是金屬螯合劑。六、項目總結(jié)及練習(xí)3.豬肝經(jīng)組織搗碎機(jī)破碎細(xì)胞，制得的勻漿于3000rpm離心20～30min，所得沉淀用二倍體積1mol/LNaCl溶液抽提1h。請問什么叫抽提？抽提是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚?，使?xì)胞破碎后的目的成分充分地溶解到提取液中的過程。六、項目總結(jié)及練習(xí)4.RNP和DNP經(jīng)0.14mol/LNaCl溶液處理并離心分離后，可分別用蛋白質(zhì)變性沉淀劑來去除其中的Protein。請列舉4種常用的蛋白質(zhì)變性沉淀劑。

①氯仿；②苯酚；③十二烷基硫酸鈉（SDS）；④三氯醋酸等。六、項目總結(jié)及練習(xí)5.為有效去除RNP和DNP中的Protein，本項目采用等體積的氯仿及1/40體積的異戊醇振搖30min。請問異戊醇的作用是什么？異戊醇的作用是消泡和有助于分相。六、項目總結(jié)及練習(xí)6.在經(jīng)氯仿去除蛋白質(zhì)并離心后的上清液中，加入2倍體積的冷95%乙醇，低溫放置15min，3000rpm離心20min，所得沉淀即為RNA或DNA沉淀。請問95%乙醇的作用是什么？核酸不溶于乙醇，乙醇主要起沉淀和除鹽作用。六、項目總結(jié)及練習(xí)7.地衣酚又叫什么？在臨床上有何用途？用其鑒定RNA的條件和原理是什么？地衣酚又稱苔黑酚、地衣二酚、3,5-二羥基甲苯、苔黑素等。臨床上，已廣泛用于治療淺層霉菌病和霉菌性陰道炎。

RNA水解后得到核糖，在濃酸中脫水環(huán)化生成糠醛，后者與地衣酚，形成藍(lán)綠色復(fù)合物，在670nm處有一最大吸收峰。在一定濃度下，RNA濃度與吸光度成線性關(guān)系。

8、金屬螯合劑

（metalchelatingagent）

金屬螯合劑可以通過螯合劑分子與金屬離子的強(qiáng)結(jié)合作用，將金屬離子包合到螯合劑內(nèi)部，變成穩(wěn)定的，分子量更大的化合物，從而阻止金屬離子起作用，可以用于解毒，印染，阻垢等方面。

四、蛋白質(zhì)的變性影響因素：溫度紫外線、超聲波劇烈震蕩、攪拌強(qiáng)酸、強(qiáng)堿有機(jī)溶劑、表面活性劑重金屬鹽胍、尿素等第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)4、SOD活力測定（鄰苯三酚自氧化法）分別檢測提取液、粗酶液、酶液1、酶液2中SOD活力。試劑/ml空白管OD1OD2對照管提取液粗酶液酶液1酶液2pH8.3緩沖液333333SOD提取液000.10.10.10.1蒸餾水21.81.71.71.71.7室溫放置20min鄰苯三酚00.20.20.20.20.2加入鄰苯三酚后迅速混勻，準(zhǔn)確計時4min，加一滴濃鹽酸停止反應(yīng)，420nm測吸光值。

分別從1ml備用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍數(shù)稀釋,260nm/280nm測定吸光值,按公式計算蛋白質(zhì)濃度.提取液稀釋:50×粗酶液稀釋:20×酶液稀釋:10×蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=(1.45A280–0.74A260)×稀釋倍數(shù)5、溶液中可溶性蛋白含量測定6、計算：酶活力單位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反應(yīng)液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)到50%時的酶量)總活力U=活力單位×總體積比活力U/mg=活力單位/蛋白質(zhì)濃度純化倍數(shù)=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)總活力/提取液總活力酶活力單位酶活力的高低以酶活力單位（U）表示。酶活力單位的含義是指酶在最適條件下，單位時間內(nèi)，酶催化底物的減少量或產(chǎn)物的生產(chǎn)量。1961年國際酶學(xué)會議規(guī)定：