基因打靶技術(shù)課件

基因打靶技術(shù)

葉亞新基因打靶研究背景基因轉(zhuǎn)移技術(shù)顯微注射、電穿孔、磷酸鈣沉淀及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染等導(dǎo)入的外源基因在靶細(xì)胞基因組中整合的位點一般是隨機(jī)的可能導(dǎo)致下面幾種情況出現(xiàn)：①導(dǎo)入的外源基因整合入某一正常基因的中部，導(dǎo)致該正?；虮磉_(dá)的缺失；②導(dǎo)入的外源基因整合入細(xì)胞內(nèi)正?；虻膫?cè)翼序列，影響了其周圍正?；虻幕钚?；③外源基因的導(dǎo)入有可能激活細(xì)胞內(nèi)的原癌基因；④導(dǎo)入的外源基因由于其整合位點的不適，而在細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或表達(dá)難以控制。解決辦法：將外源基因?qū)腩A(yù)先確定的位點。

即對細(xì)胞內(nèi)靶位點進(jìn)行定點修飾——基因打靶，什么是基因打靶？基因打靶（genetargeting）是指外源DNA與受體細(xì)胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生重組，并整合在預(yù)定位點，改變細(xì)胞遺傳特性的方法

建立在胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES細(xì)胞）與同源重組技術(shù)基礎(chǔ)之上的基因打靶技術(shù)是一種定向改變生物活體遺傳信息的實驗手段基因打靶原理生物界同源重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為基因打靶奠定了堅實的理論基礎(chǔ)，而胚胎干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了基因打靶的廣泛應(yīng)用。同源重組(Homologousrecombination)又稱一般性重組或非特異性重組(Generalrecombination)，是指相似的DNA交換遺傳信息的過程,外源DNA片段可與宿主基因組的相應(yīng)片段發(fā)生交換（即重組）。ES細(xì)胞是一類具有在體外培養(yǎng)條件下保持未分化狀態(tài)的增殖能力及分化為多種細(xì)胞類型的細(xì)胞。2024/1/7蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新基因打靶的原理基因打靶的主要步驟2、外源DNA導(dǎo)人的方式

外源DNA導(dǎo)人的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。目前應(yīng)用最廣的是顯微注射法。顯微注射每次只能注射一個細(xì)胞；電穿孔法可同時使許多細(xì)胞得到轉(zhuǎn)染。Mansour等研究發(fā)現(xiàn)電穿孔可使1％的ES細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法利用某些病毒與組織細(xì)胞有特異的親合力，可用于時空特異性基因打靶，在人類疾病的基因治療方面具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3.基因打靶的篩選方法（1）正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection,PNS)解決了定點整合與隨機(jī)整合的鑒別問題。同源重組時，只有載體的同源區(qū)以內(nèi)部分發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除。隨機(jī)整合時，是在載體的兩端將整個載體連入染色體內(nèi)。正選擇基因多為neo基因，位于同源區(qū)內(nèi)，其在隨機(jī)整合和同源重組中均可正常表達(dá)。負(fù)選擇基因常用HSV-tk基因，在靶基因同源區(qū)之外，位于載體的3’末端，在同源重組時，tk基因?qū)⒈磺谐鴣G失，在隨機(jī)整合時，所有的序列均保留（包括tk）。3.基因打靶的篩選方法（1）正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection,PNS)

無毒的丙氧鳥苷（GANC）毒性核苷酸殺死細(xì)胞篩選排除隨機(jī)整合的細(xì)胞株。同源重組時，G418和GANC都有抗性，隨機(jī)整合時對G418有抗性，但對GANC敏感，細(xì)胞將被殺死，無整合的將被G418殺死。

用G418作正篩選，選出含有neo基因的細(xì)胞株，再用丙氧鳥苷作負(fù)篩選淘汰含有tk基因的細(xì)胞株，保留未含有tk基因的同源重組細(xì)胞株。胸苷激酶蛋白（TK）2024/1/7蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新基因打靶的篩選3.基因打靶的篩選方法（2）正相選擇法（positiveselectionmethod）主要程序：將標(biāo)記基因neor的啟動子和起始密碼剪切掉，再嵌合入打靶載體中與靶位點同源的序列內(nèi)，將打靶載體轉(zhuǎn)染進(jìn)靶細(xì)胞，

可能出現(xiàn)下面幾種情況：①打靶載體不整合入靶細(xì)胞基因組，將隨傳代而丟失；②外源打靶序列隨機(jī)整合，由于neor基因缺失了其自身的啟動子和起始密碼，整合位點周圍亦無啟動子，使neor基因的表達(dá)受阻；③雖是隨機(jī)整合，但其整合位點側(cè)翼序列在其它基因的啟動子能啟動neor基因的表達(dá)；④外源打靶載體與靶位點發(fā)生了同源重組，則neor基因可借助靶基因自然存在的啟動子和起始密碼的作用而呈現(xiàn)表達(dá)活性。

因此，如用G418篩選，則抗性細(xì)胞中將只包含后兩種可能情況，根據(jù)這兩種情況下基因組DNA酶切圖譜的不一致，用Southern印跡雜交即可檢測出同源重組的克隆。4.基因打靶的策略完全基因剔除(completeknotk-out)的策略大規(guī)模隨機(jī)基因剔除—基因捕獲(genetrapping)精細(xì)突變的引入條件性基因打靶打了就走策略

(HitandRun法)“標(biāo)記和置換”法

(TagandExchange)4.基因打靶的策略借助于陽性選擇標(biāo)記基因通常被插入靶基因功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過同源重組刪除靶基因最重要的功能域，實行靶基因的完全剔除。陽性選擇標(biāo)記基因常采用β-半乳糖苷酶基因（lacZ），將其以正確的讀框插入靶基因的外顯子中，除了剔除靶基因外，通過分析β-半乳搪苷酶的活性可以研究靶基因表達(dá)的時空順序。完全基因剔除(completeknotk-out)的策略4.基因打靶的策略大規(guī)模隨機(jī)基因剔除—基因捕獲(genetrapping)可以建立一個攜帶隨機(jī)插入突變的ES細(xì)胞庫，neo基因插入到ES細(xì)胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實現(xiàn)表達(dá)的ES克隆可以很容易地在含G418的選擇培養(yǎng)基中篩選出來。中靶基因的信息可以通過篩選標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來獲得。

在單次實驗中可以獲得數(shù)以百計的帶有單基因剔除的ES克隆。但此方法的缺點是只能剔除在ES細(xì)胞中表達(dá)的基因。4.基因打靶的策略打了就走策略(HitandRun法)這一方法包括兩次同源重組：第一步（Hit）用插入型載體進(jìn)行同源重組，這樣會在靶位點插入帶有突變的基因組序列以及載體骨架，載體骨架上帶有兩個篩選標(biāo)記（如正篩選標(biāo)記基因neo和負(fù)篩選標(biāo)記基因tk）。第二步（Run）利用tk抗性篩選，富集為數(shù)不多的發(fā)生了染色體內(nèi)重組的克隆。染色體內(nèi)重組去除了含有負(fù)篩選標(biāo)記基因的載體序列，由于負(fù)篩選標(biāo)記基因的消失，細(xì)胞就恢復(fù)了對負(fù)篩選藥物的抗性，因此，回復(fù)突變體可以在負(fù)選擇培養(yǎng)基中存活