蛋白質的通性、純化和表征

Protein第3章

蛋白質的通性、純化和表征

蛋白質含有酸/堿AA殘基具有兩性堿/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白質的兩性電離及等電點蛋白質可作為多價離子，所帶電荷的符號和數(shù)量是由蛋白質分子中的可解離基團的種類和數(shù)目以及溶液的pH值所決定的。一種蛋白質的等電點與它所含的酸性氨基酸和堿性氨基酸的數(shù)目的比例有密切關系。當溶液中沒有鹽類干擾時，蛋白質分子本身的質子供體基團解離出來的質子數(shù)與它的質子受體基團結合的質子數(shù)相等時的溶液pH值稱為等離子點〔Isoionicpoint，或稱等離點〕，是每種蛋白質的一個特征性常數(shù)。二、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀〔一〕膠體性質〔colloidalsystem〕膠體溶液的特點：分子直徑在1-100nm內(nèi)溶于水不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定因素：１.分散相的質點大小在1-100nm之間，這樣大小的質點在動力學上是穩(wěn)定的，介質分子對這種質點的碰撞的合力不等于零，因此可在介質中作不斷的布朗運動。２.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥，不易聚集成大顆粒而沉淀。３.分散相的質點能與溶劑形成溶劑化層，如與水形成水化層，質點有了水化層，相互間不易靠攏而聚集。蛋白質溶液具有丁達爾效應、布朗運動以及不能通過半透膜等性質當一束光線透過膠體，從入射光的垂直方向可以觀察到膠體里出現(xiàn)的一條光亮的“通路〞，這種現(xiàn)象叫丁達爾現(xiàn)象，也叫丁達爾效應〔Tyndalleffect〕、丁澤爾現(xiàn)象、丁澤爾效應?！捕车鞍踪|的沉淀Pr從膠體溶液中析出Ⅰ可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結構和性質沒有變化適當條件下可重新溶解——非變性沉淀pI沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等

不可逆沉淀強烈沉淀條件破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性也破壞Pr結構和性質沉淀不能再重新溶解——變性沉淀如加熱沉淀、強酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等Ⅱ1.鹽析法參加中性鹽〔硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等〕脫去蛋白質的水化層，鹽析一般不引起變性等電點沉淀的蛋白質溶液中參加NaCl后沉淀溶解—鹽溶原因？鹽溶—鹽析分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶鹽析向蛋白質溶液中參加大量硫酸銨后蛋白質會沉淀析出原因？蛋白質脫去水化層而聚集沉淀鹽析（（NH4）2SO4）2.有機溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質點間的相互作用3.等電點沉淀4.重金屬鹽沉淀當溶液pH值大于等點電時，蛋白質顆粒帶負電荷，它與重金屬離子結成不溶性鹽而沉淀。5.生物堿試劑和某些酸類沉淀與帶正電荷蛋白質生成不溶性鹽。6.加熱變性沉淀天然結構解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)。當采用化學法對蛋白質進行修飾改造時，需要單一蛋白質作為原材料。為了檢驗蛋白質工程的效果，需要單一蛋白質作為實驗材料研究其結構與功能。為了生產(chǎn)出性能比現(xiàn)有蛋白質更優(yōu)異、更符合人類需要的蛋白質產(chǎn)品，需要對設計改造過的蛋白質進行大量純化，從而開發(fā)出相關產(chǎn)品?！惨弧车鞍踪|別離純化及鑒定是蛋白質研究的根底，其理由如下：基于此，我們認為蛋白質的別離純化在蛋白質工程中占有舉足輕重的作用，但其別離和純化以什么為依據(jù)呢？三、蛋白質別離純化的一般原那么(二)蛋白質別離提純的一般原那么兩大原那么：〔1〕增加蛋白質制品的純度，即增加單位蛋白質重量中所要的蛋白質的含量。〔2〕盡量使獲取的蛋白質產(chǎn)量最大化?！繕说鞍踪|的別離純化程序主要包括:⑴材料的選擇；⑵組織勻漿和破碎細胞獲取粗提取液；⑶蛋白質初步提純；⑷選擇一種或幾種適宜的方法除去雜蛋白，直至完全純化；⑸目標蛋白的鑒定。用于研究目的蛋白質通常應保持它的生物活性。因此，在目標蛋白質的整個別離純化過程中要在較低溫度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白質降解的酶)的抑制劑，防止使用劇烈條件，以免破壞蛋白質特定的折疊結構?？偰繕耍涸黾又破芳兌然虮然?.前處理：因動/植物/細菌而異2.粗分級別離：采用鹽析/等電點沉淀/有機溶劑分級別離等方法3.細分級別離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結晶四、蛋白質的別離純化方法〔一〕根據(jù)分子大小不同的純化方法

１、透析法利用半透膜〔semipermeablemembrane〕對溶液中不同分子的選擇性透過作用，可以將蛋白質與其他小分子物質分開。按照分子大小進行別離。別離取決于透析袋截留的分子量。透析液濃縮的蛋白混合樣品透析袋開始透析處于平衡狀態(tài)磁力攪拌器透析前透析后透析袋通過透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白質不能通透透析袋，留在透析袋內(nèi)。從而，蛋白質溶液中的小分子物質通過透析被分離除去。２、超濾〔ultrafiltration〕法:在一定的壓力下，使蛋白質溶液在通過一定孔徑的超濾膜時，小分子量物質濾過，而大分子量的蛋白質被截留，從而到達別離純化的目的。這種方法既可以純化蛋白質，又可到達濃縮蛋白質溶液的目的。磁力攪拌器待超濾的蛋白質溶液加壓的氮氣超濾膜３、密度梯度〔區(qū)帶〕離心60000~80000轉/分重力60萬～80萬倍滴加樣品4%8%12%16%20%塑料離心管蔗糖密度梯度（介質還可用：氯化銫、甘油等）蔗糖濃度%分子量由小—————

大

凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等，依據(jù)是多孔的載體對不同體積和不同形狀分子的排阻能力的不同，從而對混合物進行別離。４.凝膠過濾優(yōu)點：凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，溫度范圍廣，不需要有機溶劑，別離效果好缺點：樣品被不斷稀釋，上樣量不能太大，否那么分辨率變差一、原理凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結構的物質，每個顆粒的細微結構及篩孔的直徑均勻一致，小分子可以進入凝膠網(wǎng)孔，而大分子那么排阻于顆粒之外。大分子物質沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動，流程短，移動速率快，先被洗出層析柱小分子物質可通過凝膠網(wǎng)孔進入顆粒內(nèi)部，然后再擴散出來，故流程長，移動速度慢，最后被洗出層析柱1、體積參數(shù)分子在柱中移動的速度取決于該分子在固定相和流動相間的分配系數(shù)Kd，Kd表示某一分子在特定的凝膠柱內(nèi)的洗脫行為。Kd＝(Ve一Vo)／ViVe

洗脫體積Vo外水體積Vi內(nèi)水體積外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。內(nèi)水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。洗脫體積(Ve)=外水體積(Vo)該成分的分子全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中，因而洗脫速度最快。即該成分的Kd＝0。Vi＝Ve-Vo該成分不被排阻而可完成進入凝膠顆粒內(nèi)部,因而洗脫速度最慢。即該成分的Kd=l。Kd值介于0-l之間，物質的洗脫速度隨其Kd值的增加而降低一般物質的Kd值是0<Kd<l。

洗脫行為可以有三種可能的情況:

凝膠Kd＝0Kd=l0<Kd<l2、影響別離效果的因素流速加樣體積樣品濃度離子強度①流速

影響洗脫液流速的因素洗脫液加在柱上的壓力

為保持層析過程中恒定的壓力，可使用恒壓瓶。凝膠交聯(lián)度凝膠顆粒大小

流速過低樣品橫向擴散增大，峰變寬，分辨率降低，洗脫時間長流速過高洗脫峰重疊，柱壓增大，別離效果變差線性流速控制在2～10cm/h②加樣體積體積過大

平臺洗脫峰或相鄰峰重疊體積過小目的蛋白收集量少、濃度低③樣品濃度進樣前，樣品應高度濃縮，濃度為10～20mg/ml分組別離&脫鹽除雜適當提高樣品濃度分級別離&分析性實驗濃度低④離子強度可防止蛋白質與蛋白質之間或與凝膠介質之間的相互作用常用鹽溶液：

20-100mmol/LNaCl濃度過高引起凝膠柱床體積變化二、凝膠過濾層析的介質

葡聚糖系列瓊脂糖系列聚丙烯酰胺系列多孔硅膠1、葡聚糖系列以微生物產(chǎn)生的葡聚糖Dextran為原料用環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑，在堿性條件下交聯(lián)而成商品的凝膠，稱為Sephadex先制成丙烯基的衍生物，然后再用N，N’-甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)，得到商品化的凝膠，被稱為Sephacryl2、瓊脂糖系列

較常用的是Pharmacia和BioRad兩家的產(chǎn)品，前者生產(chǎn)的稱為Sepharose，后者的產(chǎn)品為BioGelA。BioGelA系列的產(chǎn)品有不同的顆粒度，有粗、中和細三檔，它們的顆粒度分別為l50μm～300μm，80μm～150μm和40μm～80μm。

3、聚丙烯酰胺系列由丙烯酰胺單體和雙丙烯酰胺混合物聚合得到的多孔性物質。產(chǎn)物也是固體粉末，用前先溶漲。

4、多孔硅膠優(yōu)點：物理化學穩(wěn)定性高，耐熱耐壓，使用壽命長缺點：柱效較低、外表具有離子性，對蛋白質有吸附性、不能在強堿性環(huán)境中使用剛性親水性填料，具有一定直徑的多孔網(wǎng)狀結構的球狀顆粒三、根本操作凝膠的選擇凝膠柱的制備上樣洗脫凝膠柱的重復使用與保存1、凝膠的選擇

分組別離根據(jù)樣品中的大分子和小分子分配系數(shù)上的顯著差異，將其分開?？蛇x用SephadexG-25和G-50小肽和低分子量的物質〔1000-5000〕的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。分級別離將樣品中一些分子量比較近似的物質進行別離。選用分級范圍較窄的凝膠，且中間值接近于目的蛋白的分子量

顆粒大小的影響優(yōu)點缺點小顆粒分離效果好流速慢分離時間長大顆粒流速快區(qū)帶擴散洗脫峰平而寬2、凝膠柱的制備

用于分組別離短而粗L/D值＜10用于分級別離L/D值比較大對很難別離的組分一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1～5cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應，大于5cm那么稀釋現(xiàn)象嚴重。柱L/D值的選擇裝柱前，凝膠基質用蒸餾水或洗脫液充分溶脹。凝膠柱填裝后通?？梢圆捎靡环N有色的物質進行鑒定，如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區(qū)帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度。如果色帶狹窄，平整、均勻下降，那么說明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用。如果色帶彌散、歪曲，那么需要重新裝柱。此外，有時為了防止新凝膠柱對樣品的吸附，可以用一些物質預先過柱，以消除吸附。3、上樣粘度因素粘度過大，分子因運動受限制，影響進出凝膠孔隙，洗脫峰形寬而矮，有些可別離的組分因此重疊。分級別離加樣體積約為凝膠柱床體積的1％～5％左右分組別離加樣體積約為凝膠柱床體積的10％～25％4、洗脫水別離不帶電荷的中性物質電解質溶液〔酸、堿、鹽的溶液〕別離帶電基團的樣品水與有機溶劑的混合液〔水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮〕用于吸附較強的組分洗脫液5、凝膠柱的重復使用與保存當樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可以參加新的樣品，繼續(xù)使用。保存液相中保存：于凝膠懸液中參加防腐劑或高壓滅菌后4℃保存。在半收縮狀態(tài)下保存：60%-70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小枯燥狀態(tài)保存：長期不用，水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇四、凝膠層析的應用

脫鹽別離提純測定高分子物質的分子量高分子溶液的濃縮蛋白質復性研究1、脫鹽高分子溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。優(yōu)點：操作簡便、快速、蛋白質和酶類等不易變性適用的凝膠：

SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、62、別離提純凝膠過濾的載體可以根據(jù)它們的孔徑分為很多種不同的規(guī)格。每種規(guī)格都有其特定的分級的范圍，一旦超出分組范圍，不管是其上限還是下限，即使分子量有大有小，但載體的排阻情況根本相同，就不能別離。在凝膠過濾層析時，要根據(jù)所要純化的樣品的分子量選擇所用的凝膠過濾的基質。天花粉毒蛋白的凝膠過濾別離交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50柱(1.8cm×100cm)用50mmol/LTris-HCl,pH7.8緩沖液平衡天花粉硫酸銨糊(90％飽和度的沉淀)溶于2m1平衡緩沖液中上樣洗脫天花粉毒蛋白除去不溶物↓↘↘↓

3、測定高分子物質的分子量測大于所用載體上限分子的洗脫體積測小于下限的分子的洗脫體積標定凝膠過濾柱的Vo標定凝膠過濾柱的Vi測定一系列已知分子量的標淮樣品在柱上的洗脫體積Ve以(Ve-Vi)／(Vo-Vi)和1ogMw作圖測得了待測分子量的樣品的Ve由(Ve-Vi)／(Vo-Vi)從標準曲線上可以求得未知樣品的分子量藍色葡聚糖氨基酸、有色鹽類↓↓↓↓↓↘↙以標準樣品的分子量的1ogMw對Ve作圖or

洗脫液中蛋白質濃度4、高分子溶液的濃縮將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內(nèi)部高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外離心或過濾，去除溶脹的凝膠濃縮的高分子溶液↓5、蛋白質復性研究變性蛋白加入凝膠柱高濃度變性劑存在，蛋白呈無規(guī)則卷曲變性蛋白體積大，只能進入顆粒間隙，遷移速度快變性劑分子量小，進入顆粒內(nèi)部，遷移速度慢緩沖液洗脫蛋白變性劑濃度降低，轉成復性緩沖液變性蛋白復性，以天然形態(tài)洗脫出柱↓↓↓↓↓↓〔二〕利用溶解度差異的純化方法1.等電點沉淀調(diào)整溶液pH不同蛋白在各自pI處依次沉淀

2.鹽溶和鹽析3.有機溶劑分級別離法降低介電常數(shù)爭奪水化膜類型：1、區(qū)帶電泳紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、粉末電泳、細絲電泳、凝膠電泳凝膠電泳包括：瓊脂糖凝膠、淀粉凝膠、硅膠凝膠、聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠包括：垂直板電泳、盤狀電泳、等電聚焦電泳、梯度電泳、免疫電泳2、自由界面電泳：支持物為溶液，很少用〔三〕利用電泳的純化方法1、聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質在電場中的遷移率取決于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。參加SDS〔十二烷基磺酸鈉〕和少量巰基乙醇，那么蛋白質分子的遷移率主要取決于它的分子量，而與原來所帶電荷、分子形狀無關。SDS是變性劑，它能破裂蛋白質分子中的氫鍵和疏水作用。巰基乙醇翻開二硫鍵，因此使蛋白質分子處于伸展狀態(tài)。此時SDS以其烴鏈與蛋白質分子的側鏈結合成復合物，大約每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子。SDS的作用：1、由于SDS是陰離子，使多肽外表覆蓋的負電荷遠遠超過蛋白質分子原有的電荷量，消除了原來的電荷差異。2、改變了蛋白質單體分子的構象，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都相同，長軸長度隨其分子量的大小成正比變化。由于不同蛋白質的SDS復合物具有相同的荷質比，并具有相似的構象，因而有如下公式：lgM=K1—K2R〔K1、K2為常數(shù)，R為相對遷移率〕實際測定時，以幾種標準單體蛋白質分子量的對數(shù)值對其R作圖，根據(jù)樣品的R值，從標準曲線上就可查出其分子量。2.Isoelectricfocusing〔等電聚焦〕(1)以不同蛋白質的等電點的差異別離。(2)凝膠中含有蛋白質樣品和載體兩性電解質。(3)載體兩性電解質：a是一系列物質的混合物。此混合物各組分的等電點要互不相同，但又不能相差太大〔小數(shù)點后2位〕；最常用為范圍，還有、。b混合物中各物質在等電點時要有足夠大的電導，以保證能順序排列；c混合物中各物質在等電點時要有足夠大的緩沖能力，構成組分為多氨基、多羧基的脂肪族化合物；d要求各組分分子量要小，易于與蛋白質別離。通電后，在介質中由于H+與OH-的移動，形成了從的一系列pH梯度。當載體兩性電解質移動到各自的等電點時，就停止移動，不帶電荷，并維持pH梯度〔電導、緩沖能力〕。即：pH梯度由H+與OH-建立，而由載體兩性電解質來維持。當?shù)鞍踪|移動到相應的pH值處，結束。本卷須知：1、時間相對長對別離有利；2、也可用來測定蛋白質的等電點?！菜摹忱脤ε潴w的特異生物學

親和力的純化方法親和色譜顆粒具有極強的專一性一、親和層析的原理親和力生物分子間存在很多特異性的分子之間的相互作用，如抗原－抗體、酶－底物或抑制劑、激素－受體等，它們之間都能夠專一而可逆的結合。別離原理通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行別離純化。重組蛋白用基因工程的方法引入特殊結合位點〔如金屬結合位點〕，將其加在重組目的蛋白的氨基端或羧基端。緊鄰結合位點的位置參加蛋白酶切割位點，以便在用親和層析純化之后，將多余的蛋白質片段去掉。

二、親和層析用基質具有較好的物理化學穩(wěn)定性能夠和配體穩(wěn)定的結合結構為均勻的多孔網(wǎng)狀結構與樣品中的各個組分均沒有明顯的非特異性吸附

1、各類基質優(yōu)缺點優(yōu)點缺點纖維素價格低、活性基團較多非特異性吸附強、穩(wěn)定性和均一性較差交聯(lián)葡聚糖穩(wěn)定性較好孔徑較小、穩(wěn)定性不好聚丙烯酰胺同上同上瓊脂糖非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑均勻適當、宜于活化多孔玻璃機械強度好，化學穩(wěn)定性好活性基團較少、對蛋白質有較強的吸附作用

2、基質的活化溴化氰活化環(huán)氧乙烷基活化

指通過對基質進行一定的化學處理，使基質外表上的一些化學基團轉變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結合的活性基團。溴化氰活化生成亞胺碳酸活性基團，它可以和伯氨(NH2)反響，主要生成異脲衍生物缺點：非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。與配體結合不夠穩(wěn)定溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，操作不便。環(huán)氧乙烷基活化

活化后的基質都含有環(huán)氧乙烷基，可以結合含有伯氨基(NH2)、羥基(OH)和硫醇基(SH)等基團的配體優(yōu)點不引入電荷基團，與配體形成的N－C、O－C和S－C鍵都很穩(wěn)定，使用壽命長缺點與配體偶聯(lián)時需要堿性條件，溫度為20~40℃，對于一些比較敏感的配體可能不適用多種商品化的活化基質

三、配體與待別離的物質有適當?shù)挠H和力與待別離的物質之間的親和力要有較強的特異性與基質穩(wěn)定的共價結合自身應具有較好的穩(wěn)定性配體的分類特異性配體只與單一或很少種類的蛋白質等生物大分子結合的配體eg.抗原和抗體、酶和它的抑制劑

通用性配體特異性不是很強，能和某一類的蛋白質等生物大分子結合的配體eg.凝集素可以結合各種糖蛋白

配體待純化的蛋白質配體待純化的蛋白質抗原特定單克隆抗體或多克隆抗體肝素凝聚因子、脂酶、結締組織蛋白酶、DNA聚合酶單克隆抗體特定抗原膽固醇膽固醇受體、膽固醇結合蛋白蛋白質A/蛋白質G免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸結合蛋白、白蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶核苷酸核苷酸結合蛋白、需核苷酸的酶磷酸磷酸酶苯基硼酸鹽糖蛋白三嗪染料脫氫酶、激酶、聚合酶、限制酶、干擾素凝集素糖蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶糖凝集素、糖苷酶蛋白質親和層析中的適宜配體四、根本操作選擇適當?shù)呐潴w將配體固定化到基質上將目的蛋白混合液加樣到基質上除去非特異性結合的蛋白質洗脫純的目的蛋白1、上樣層析柱較短，通常10cm左右樣品液的濃度不宜過高上樣時流速比較慢樣品緩沖液中有一定的離子強度上樣時選擇適當較低的溫度2、洗脫特異性洗脫指利用洗脫液中的物質與待別離物質或與配體的親和特性而將待別離物質從親和吸附劑上洗脫下來。

非特異性洗脫指通過改變洗脫緩沖液pH、離子強度、溫度等條件，降低待別離物質與配體的親和力而將待別離物質洗脫下來。特異性洗脫

選擇一種和配體親和力較強的物質參加洗脫液，這種物質與待別離物質競爭對配體的結合，在適當?shù)臈l件下，如這種物質與配體的親和力強或濃度較大，配體就會根本被這種物質占據(jù)，原來與配體結合的待別離物質被取代而脫離配體，從而被洗脫下來。選擇一種與待別離物質有較強親和力的物質參加洗脫液，這種物質與配體競爭對待別離物質的結合，在在適當?shù)臈l件下，如這種物質與待別離物質的親和力強或濃度較大，待別離物質就會根本被這種物質結合而脫離配體，從而被洗脫下來。

優(yōu)點：特異性強，可以進一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率。可防止蛋白質變性缺點：較常的時間、較大的洗脫條件。改善方法：選擇親和力強的物質洗脫、加大洗脫液濃度特異性洗脫非特異性洗脫與配體親和力較小連續(xù)大體積平衡緩沖液沖洗，不影響活性，但洗脫體積較大，待別離物質濃度較低。配體結合較強時適當?shù)膒H、離子強度洗脫，注意盡量不影響待別離物質的活性與配體結合非常牢固時使用較強的酸、堿或在洗脫液中參加脲、胍等變性劑，使蛋白質等待別離物質變性，洗脫后再復性3、吸附劑的再生和保存再生用大量的洗脫液或較高濃度的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡嚴重的不可逆吸附時，使用高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑或參加適當?shù)姆菍Ｒ恍缘鞍酌副４鎱⒓?.01%的疊氮化鈉，4°C下保存五、親和層析用于蛋白質別離的實例免疫親和層析凝集素和糖蛋白親和層析含有輔酶的酶類的親和層析酶和蛋白類型抑制劑的親和層析肝素為配體的親和層析染料配體親和層析金屬螯合層析1、免疫親和層析

小鼠血清不同亞型IgG的別離1m1的A蛋白SepharoseCL-4B柱用1.5mol/L的甘氨酸-NaOH，pH8.9的緩沖液(內(nèi)含3mol／LNaCl)平衡

5m1小鼠血清同等體積的平衡液稀釋后上柱

洗去不吸附的蛋白質

用不同pH的0.1mol/L檸檬酸洗脫

↓↓↓

2、凝集素和糖蛋白的親和層析別離凝集素是在自然界廣泛存在的一大類糖結合蛋白。它們具有不同的糖結合專一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖鏈結合的糖蛋白，可以有效地別離純化不同型的凝集素，也可應用固定化的凝集素別離純化各種糖蛋白。用10mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.0，含0.15mol/LNaCl)平衡酸處理的Sepharose6B(AT-6B)

天花粉的丙酮粉制劑用平衡液抽提后，上AT-6B柱洗去不吸附的雜蛋白

用0.2mol/L的半乳糖溶液洗脫花粉凝集素↓↓↓ⅰ.用含有半乳糖的天然多糖-瓊脂糖的交聯(lián)產(chǎn)物別離天花粉凝集素

ⅱ.糖蛋白親和層析不同的糖蛋白具有不同的單相組分和糖鏈結構，它們和不同的凝集素呈現(xiàn)出不同的結合能力。常用的凝集素：

ConA、LCA對甘露糖專一WGA對N-乙酰氨基葡萄糖專一人血色素結合蛋白(hemopexin)的別離

用50mmol/L的磷酸緩沖液，pH7.0(含0.2mol/LNaCl)平衡固定化的WGA柱離子交換層析得到含有血色素結合蛋白和轉鐵蛋白的級分上柱平衡液洗脫不結合在柱上的轉鐵蛋白含有100mg／m1N-乙酰氨基葡萄糖的平衡液洗脫血色素結合蛋白↘↙↓↓回收率達91％

豬淋巴細胞質膜糖蛋白的別離1％的脫氧膽酸鈉增溶膜蛋白

上固定化的LCA柱(1cm×8cm)

用1％的脫氧膽酸鈉洗滌親和柱，除去雜蛋白用含2％α-甲基甘露糖苷的1％的脫氧膽酸鈉洗脫膜糖蛋白↓↓↓3、含有輔酶的酶類的親和層析很多的酶中都含有不同類型的輔酶，最為常見的是氧化復原酶和脫氫酶含有NAD。為此用固定化的NAD可以別離不同類型的氧還酶和脫氫酶，或激酶↓↓↓固定化NAD柱

4、酶和蛋白類型抑制劑的親和層析

一些酶及其抑制劑間存在著非常專一的相互作用。一些酶的抑制劑被固定化以后，就可用于一些酶的別離純化。一些固定化的酶也被應用于蛋白類型的抑制劑的別離。為了防止位阻現(xiàn)象，在酶類的小分子抑制劑固定化時，常要插入一些不同長度的“手臂〞，如插入8-9個原子胰蛋白酶抑制劑的別離純化部分純化的牛卵巢胰蛋白酶抑制劑溶于2mlpH4.0的乙酸緩沖液

流經(jīng)用同一緩沖液平衡的固定化胰蛋白酶柱

平衡液可洗去雜蛋白

用0.1mol／L的HCl，pH約1.2的溶液(內(nèi)含0.5mol／LNaCl和10mmol/LCaCl2)洗脫胰蛋白酶抑制劑

↓↓↓大腸桿菌EcoPl的別離將大腸桿菌抽提液經(jīng)monoQ柱和固定化的肝素柱純化至80%純度上用特定序列(AGACC)的寡脫氧核苷酸和溴化氰活化的交聯(lián)瓊脂糖偶聯(lián)成的親和層析柱用10體積平衡液(10mmol/LTris-HCl，pH7.6，0.3mol/LNaCl，lmmol／LEDTA)充分洗滌用2體積的lmol/LKCl解析吸在親和柱上的EcoP1↓↓↓5、肝素為配體的親和層析

肝素是蛋白聚糖中的一種，可以和許多類型的蛋白質結合。6、染料配體的層析

染料樹脂不專一的親和介質優(yōu)點穩(wěn)定、和許多類型的酶結合，但又不被酶所作用、價格低廉

eg.Cibacron藍F3GA酵母中含有NAD酶的別離面包酵母抽提液加入硫酸銨至75％飽和度，離心后，取220mg沉淀溶于10m1起始緩沖液流經(jīng)用起始緩沖液平衡的藍色交聯(lián)瓊脂搪凝膠CL-4B柱

pH8.6的緩沖液中加入10mmol/L的NAD+洗脫甘油醛-3-磷酸脫氫酶在起始緩沖液中加入5mmol/LNAD+洗脫醇脫氫酶在起始緩沖液中加入20mmolNADP+洗脫葡萄糖-6-磷酸脫氫酶洗脫液的pH升至8.6時，解析己激酶↓↓↓↓↓堿性磷酸單酯酶的別離小牛小腸粘膜抽提液用DEAE離子交換纖維素除去部分雜蛋白酶活性的級分再上平衡的活性染料艷藍K-GRS和交聯(lián)瓊脂糖4B偶聯(lián)的染料層