番茄綿疫病菌抗藥性檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

1DB36/XXXXX—XXXX標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了番茄綿疫病菌抗藥性檢測(cè)的術(shù)語(yǔ)和定義及檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于番茄綿疫病菌對(duì)殺菌劑的抗性檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB16715.3瓜菜作物種子第3部分：茄果類(lèi)GB12475農(nóng)藥貯運(yùn)、銷(xiāo)售和使用的防毒規(guī)程；NY608農(nóng)藥產(chǎn)品標(biāo)簽通則；NY/T496肥料合理使用準(zhǔn)則通則；NY/T1276農(nóng)藥安全使用規(guī)范總則；NY/T2118蔬菜育苗基質(zhì)。3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1原藥Technicalgradematerial未經(jīng)加工的農(nóng)藥原產(chǎn)物。3.2抗藥性fungicideresistance有害生物群體對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生敏感性下降的遺傳變化稱(chēng)為抗藥性。3.3抑制中濃度（EC50）Medianeffectiveconcentration（EC50）指在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，抑制50%菌絲生長(zhǎng)或孢子萌發(fā)所需的藥劑有效濃度。3.4番茄綿疫病tomatobrownrot指由疫霉屬辣椒疫霉[PhytophthoracapsiciLeonian]侵染番茄引起的一種流行性病害。2DB36/XXXXX—XXXX3.5敏感基線sensitivitybaseline在同類(lèi)作用方式的殺菌劑使用之前，靶標(biāo)病菌群體中不同菌株對(duì)一種藥劑的敏感性(EC50值)分布曲線，常用平均值及95%置信限表示。3.6人工接種artificialinoculation在適宜條件下，通過(guò)人工操作將菌餅置于含藥的平板中央，通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率來(lái)檢測(cè)病菌的抗藥性水平。4測(cè)定方法4.1菌絲生長(zhǎng)直徑法將能明顯抑制菌絲生長(zhǎng)的供試藥劑（烯酰嗎啉、霜脲氰、嘧菌酯、氟嗎啉、霜霉威、精甲霜靈、百菌清等及其混劑）與培養(yǎng)基混合，以菌絲生長(zhǎng)速率快慢來(lái)檢測(cè)番茄綿疫病菌對(duì)藥劑的抗性水平。試驗(yàn)時(shí)，先進(jìn)行預(yù)備測(cè)定，將各待測(cè)菌株移入含上述殺菌劑0.1、1.0、10、100μg·mL-1的培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)7d，根據(jù)其生長(zhǎng)情況設(shè)計(jì)正式測(cè)定時(shí)的殺菌劑系列濃度梯度。4.2培養(yǎng)基的制備4.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基取50g黑麥種子在適量去離子水中浸泡24h～36h，搗碎機(jī)搗碎，55℃~60℃水浴1h～2h，雙層紗布過(guò)濾，55℃~60℃水浴1h～2h，雙層紗布過(guò)濾，上清液補(bǔ)水至1000mL，加入瓊脂15g，121℃高壓滅菌30min。4.2.2選擇性培養(yǎng)基待基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50℃~60℃時(shí)，加入利福平20mg．L-1，氨卞青霉素200mg．L-1，70%五氯硝基苯100mg．L-1，充分搖勻后倒入培養(yǎng)皿中。4.3綿疫病樣的采集、分離和保存4.3.1菌株的采集在田間選擇剛發(fā)病的番茄葉片，裝入一次性小塑料袋內(nèi)，置于冰塊中，1天內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。4.3.2病原菌的分離3DB36/XXXXX—XXXX將采回的病葉用自來(lái)水和滅菌水沖洗干凈，涼干后，背面朝上置于滅菌過(guò)的2%瓊脂培養(yǎng)基上，16℃~20℃培養(yǎng)箱內(nèi)光暗交替（12h/12h）保濕培養(yǎng)4～5d，發(fā)病后挑取霉層置于選擇性培養(yǎng)基上，16℃~20℃培養(yǎng)8d～10d(菌落直徑長(zhǎng)至2cm～3cm)。4.3.3綿疫病菌的鑒定挑取少量分離純化的菌絲制成玻片，在100倍顯微下觀察菌體形態(tài)。當(dāng)菌體形態(tài)與附錄A相符時(shí)，則確定所分離的病菌為綿疫病菌。4.3.4病原菌的保存挑取分離出來(lái)的綿疫病菌少量菌絲置于選擇性培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中16℃~20℃黑暗培養(yǎng)2d～3d，再將菌落邊緣單菌絲的尖端連同培養(yǎng)基一起切下，置于斜面基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，16℃~20℃黑暗培養(yǎng)14d后，加入滅菌過(guò)的石蠟油（液面超過(guò)菌面約1cm），10℃黑暗保存，備用，每半年轉(zhuǎn)接1次。4.4含藥培養(yǎng)基的制作收集殺菌劑原藥，保存于避光、低溫（0℃~4℃)及干燥條件下。稱(chēng)取適量的原藥，用有機(jī)溶劑（如丙酮、甲醇、二甲亞砜等）溶解，以無(wú)菌水稀釋成母液（有機(jī)溶劑的含量應(yīng)低于總體積的1%再加入無(wú)菌水稀釋成系列濃度的藥液，按照藥液與培養(yǎng)基體積比1:9分別加入溶化的黑麥瓊脂培養(yǎng)基（RA）中，混勻，潑碟，配制成含不同濃度藥劑的RA平板。對(duì)照僅加入適量DMSO或丙酮等溶劑。4.5接種及培養(yǎng)將保存的菌株取出活化，然后在RA平板上培養(yǎng)10d，從菌落邊緣以直徑5mm打孔器打菌餅，用接種針挑取菌餅接在含藥RA平板（直徑9cm)中央，以不含藥RA平板為對(duì)照，每皿接1個(gè)菌餅，每處理重復(fù)3次。蓋上皿蓋，16～20℃培養(yǎng)10d。4.6結(jié)果檢查當(dāng)對(duì)照（即不含殺菌劑的培養(yǎng)基平板）的菌落直徑至少達(dá)到5cm時(shí)，采用垂直十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算平均值。5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析5.1毒力回歸方程的建立4DB36/XXXXX—XXXX用十字交叉法測(cè)量菌落直徑的平均值(mm)，按依以下公式算出各藥劑濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制百分率（%），抑制率（P）（%）=［（對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-處理菌落增長(zhǎng)直徑）/對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑］×100%。將菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成抑制效果機(jī)率值(Y),藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)(X)。采用SPSS、DPS等統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行藥劑濃度對(duì)數(shù)值（X）與抑制率的幾率值（Y）之間的線性回歸分析，求出每種藥劑對(duì)每個(gè)菌株的毒力回歸方程式（Y=a+bX）、相關(guān)系數(shù)和置信區(qū)間。由毒力回歸方程式求出菌株對(duì)藥劑的敏感性(EC50值)。5.2敏感基線(EC50)的建立從未使用過(guò)某種藥劑及其相同作用機(jī)理藥劑的多個(gè)代表性地區(qū)采集番茄綿疫病菌90株～110株，測(cè)定其對(duì)該藥劑的敏感性（EC50值）。將供試菌株對(duì)某種藥劑的敏感性(EC50值)劃分成不同區(qū)段（一般5個(gè)區(qū)段），確定敏感性分布范圍（例如從較小的a到較大的b)，寫(xiě)出濃度區(qū)段（等差數(shù)列）a,a+（b-a）/n,a+2（b-a）/n,a+3（b-a）/n,a+4（b-a）/n,……,a+(k-1)（b-a）/n（n為區(qū)段數(shù)，k為數(shù)列的序數(shù)），以每個(gè)區(qū)段菌株出現(xiàn)頻率（%）為縱軸，以藥劑濃度區(qū)段為橫軸，畫(huà)出敏感性分布光滑曲線圖，由n個(gè)點(diǎn)連成，每一點(diǎn)以(x,y)來(lái)表示，x=濃度區(qū)段中值，y代表該區(qū)段菌株出現(xiàn)頻率。利用DPS、SPSS等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行敏感性數(shù)據(jù)正態(tài)性分布檢驗(yàn)，如果P值>0.05，即在95%置信限內(nèi)，敏感性呈近似正態(tài)分布，則菌株可視為野生敏感菌株，其敏感性(EC50值)平均值可作為敏感基線(EC50值)。5.3抗性水平抗性水平＝敏感性（EC50值）×100/敏感基線（EC50值），抗性水平的結(jié)果保留整數(shù)。5.4菌株敏感型劃分菌株對(duì)甲霜靈（或精甲霜靈）敏感型：高抗菌株：在含5μg/mL、100μg/mL甲霜靈（或精甲霜靈）的RA平板上菌落直徑≥對(duì)照菌落直徑的40﹪;中抗菌株：在含5μg/mL甲霜靈（或精甲霜靈）的RA平板上菌落直徑＞40%對(duì)照菌落直徑，在含100μg/mL甲霜靈（或精甲霜靈）的RA平板上菌落直徑＜對(duì)照菌落直徑的40%；敏感菌株：在含5μg/mL、100μg/mL甲霜靈（或精甲霜靈）的RA平板上菌落直徑均＜對(duì)照菌落直徑的40﹪。菌株對(duì)嘧菌酯、吡唑醚菌酯、噁霜靈等高度固有抗性風(fēng)險(xiǎn)藥劑的敏感型：敏感菌株（S），敏感性（EC50值）≤敏感基線的95%置信限上限，抗性水平≤(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)；低抗菌5DB36/XXXXX—XXXX株（LR），(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)<抗性水平≤100倍；中抗菌株（MR），100倍<抗性水平≤500倍；高抗菌株（HR），抗性水平>500倍。菌株對(duì)霜脲氰、烯酰嗎啉、氟嗎啉、雙炔酰菌胺、霜霉威、氰霜唑、氟啶胺、氟吡菌胺等中低度固有抗性風(fēng)險(xiǎn)藥劑的敏感型：敏感菌株（S），敏感性（EC50值）≤敏感基線的95%置信限上限，抗性水平≤(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)；低抗菌株（LR(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)<抗性水平≤10倍；中抗菌株（MR），10倍<抗性水平≤100倍；高抗菌株（HR），抗性水平>100倍。5.5抗性頻率評(píng)估抗性頻率（%）=抗性菌株數(shù)×100/供試菌株數(shù)，抗性頻率結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后2位數(shù)字。6檢測(cè)報(bào)告的形成及歸檔建立番茄綿疫病菌抗藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，將測(cè)定的所有原始數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果、抗性水平及抗性頻率評(píng)估，按時(shí)間、地點(diǎn)建立檔案，長(zhǎng)期保存。6DB36/XXXXX—XXXX（資料性附錄）辣椒疫霉菌菌落培養(yǎng)特征及孢子囊形態(tài)特征在CA上菌落呈放射狀、絮狀，氣生菌絲中等到繁茂。菌絲形態(tài)簡(jiǎn)單，粗3-10μm。孢囊梗不規(guī)則分枝或傘形分枝，細(xì)長(zhǎng)，粗1.5-3.5μm。孢子囊形態(tài)變化甚大，從近球形、卵形、腎形、梨形到長(zhǎng)卵形、橢圓形和不規(guī)則形，40-80μm×29-52μm，平均56.7μm×42.2μm；長(zhǎng)寬比值為1.4-2.7，平