炭疽實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)-楊發(fā)蓮

炭疽實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)

云南省地方病防治所

楊發(fā)蓮

目錄一、前言二、炭疽病原檢驗(yàn)程序三、血清中炭疽抗體水平檢測四、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目五、實(shí)驗(yàn)方法六、炭疽實(shí)驗(yàn)室防護(hù)和實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)一、前言炭疽桿菌屬芽胞桿菌科（Bacillaceae），需氧芽胞桿菌屬（Bacillus），是最大的一類細(xì)菌（寬1~3μm，長5~8μm）。最佳生長溫度37℃（12~45℃），最佳生長pH為7.0~7.4。細(xì)胞結(jié)構(gòu)中有特點(diǎn)的是其多聚谷氨酸莢膜（poly-γ-D-glutamicacid，PGA），無鞭毛。炭疽桿菌的毒力因素主要是外毒素（保護(hù)性抗原PA、致死因子LF和水腫因子EF）三組分和莢膜，并分別由它僅含的兩個(gè)毒性質(zhì)粒（pX01，pX02）分別編碼和控制，失去任何一個(gè)質(zhì)粒因此也就失去其中一個(gè)毒力因素的炭疽桿菌就變成了難以致病的弱毒株。炭疽是由炭疽桿菌所引起的一種危害嚴(yán)重的人畜共患傳染病，若控制不及時(shí)就會(huì)引起大批的牲畜死亡造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響人、畜健康和生產(chǎn)力發(fā)展。隨著我國市場經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活需求的提高，飼養(yǎng)畜密度的增加，動(dòng)物性食品和毛、皮革制品的利用日趨普及，以及土地資源的開發(fā)和環(huán)境的改造，各類物資的頻繁交流，炭疽對(duì)我國人民生命安全和財(cái)產(chǎn)構(gòu)成很大威脅，如不采取及時(shí)、有效的監(jiān)控措施，炭疽發(fā)病勢將有增無減，隱患無窮。鑒于此種傳染性疾病在我國仍屬一種高、危病種，加以它尚有自外輸入我國的潛在可能，在今后加速發(fā)展市場經(jīng)濟(jì)的的新形勢下，加強(qiáng)各級(jí)領(lǐng)導(dǎo)對(duì)炭疽防制工作的重視和支持，提高廣大的基層相關(guān)工作人員對(duì)炭疽的認(rèn)識(shí)和防病能力，是很有必要的。要做到早發(fā)現(xiàn)、早治療、早控制，必須有相關(guān)豐富的流行病學(xué)和臨床知識(shí)外，一定要熟練掌握相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)。二、炭疽病原檢驗(yàn)程序

圖1示。

三、血清中炭疽抗體水平檢測（一）意義人血清中炭疽抗體水平檢測的意義主要在于下列幾個(gè)方面：正常人群血清炭疽抗體水平資料收集，特殊人群（產(chǎn)業(yè)工人、畜牧人員、實(shí)驗(yàn)室人員）血清炭疽抗體水平觀察，疫苗接種人群血清炭疽抗體水平分析，患病人群血清炭疽抗體水平研究，在患者標(biāo)本中未獲得炭疽芽胞桿菌陽性檢測和分離結(jié)果的情況下，血清抗炭疽特異性抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上升高也可以結(jié)合流行病學(xué)線索和臨床表現(xiàn)進(jìn)行確診。（二）檢測方法目前均為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

1.標(biāo)本的采集和保存：發(fā)病初期和恢復(fù)期（發(fā)病后15天左右）各采一次血，血清采集時(shí)應(yīng)盡量避免溶血，因紅細(xì)胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾讀取方法的結(jié)果，可造成假陽性，長菌的標(biāo)本同樣的道理易產(chǎn)生假陽性；抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑；標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長易導(dǎo)致血清IgG聚合，使試劑本底加深，一般血清置4℃冰箱5天內(nèi)完成測試，如需保存一周以上則要-20℃冰凍保存，融解時(shí)應(yīng)上下顛倒充分混勻，同時(shí)避免氣泡。

2.注意事項(xiàng)：ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果受操作影響很大，每個(gè)步驟包括加樣、溫育、洗滌、顯色、酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏、強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)。因此，應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)。報(bào)告方式以定量分析結(jié)果的滴度單位表示；檢測時(shí)應(yīng)以接種疫苗前或初報(bào)告病例地方的人或動(dòng)物的血清作為陰性血清，如有可能也可設(shè)陽性血清對(duì)照。陰性血清每次都要和待測標(biāo)本同時(shí)做。（三）具體程序

1.包被抗原：用包被緩沖液將已知抗原稀釋至0.3μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。洗滌緩沖液配方為：Tris2.42克，1mol/LHCI13mL,吐溫-20（0.05%）0.5mL,加蒸餾水至1000mL。

2.待檢血清反應(yīng)：加1:8稀釋(稀釋液為生理鹽水)的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育60分鐘，洗滌3次，每次3分鐘。(同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對(duì)照)

3.酶標(biāo)抗體反應(yīng)：于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)或SPA0.1ml，37℃孵育60分鐘，洗滌3次，每次3分鐘。

4.顯色反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入等體積混合的顯色底物A、B溶液0.1ml，37℃20分鐘。底物A液（磷酸鹽枸櫞酸緩沖液，pH5.0）配方為：0.2mol/LNa2HPO4(28.4g/L)25.7mL,0.1mol/L枸櫞酸(19.2g/L)24.3mL,H2O20.1%,蒸餾水50mL。底物B液[TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液]配方為：TMB3.90g,枸櫞酸10.52g,EDTA1.86g,甘油2000mL,DMSO300mL,加熱溶解后加蒸餾水至10000mL。

5.終止顯色：于各反應(yīng)孔中加入顯色終止液(0.5mol/LH2SO4)0.1mL終止反應(yīng)。

6.結(jié)果判定：實(shí)驗(yàn)結(jié)果用酶標(biāo)儀判讀，被檢孔OD值達(dá)陰性血清對(duì)照孔OD值的2.1倍時(shí)，始可判為陽性。四、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（一）標(biāo)本采集（二）細(xì)菌培養(yǎng)（三）涂片、G染色、莢膜染色、芽孢染色、光鏡檢查（四）噬菌體裂解和青霉素敏感性試驗(yàn)（五）PCR基因檢測（六）菌種保存五、實(shí)驗(yàn)方法（一）標(biāo)本采集

1.采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)遵循的原則:盡可能在抗生素治療開始前采集標(biāo)本，除必要時(shí)并在具備操作病毒細(xì)菌條件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，不得用解剖的方式獲得標(biāo)本。所需的血液與組織標(biāo)本，均應(yīng)以穿刺方式取得。所有標(biāo)本均置無菌容器中

2.血液標(biāo)本：所有疑似病例，采取血液標(biāo)本5-10ml（不加抗凝劑）。

3.皮膚損害處標(biāo)本：玻片直接在皮膚破損處壓蘸；再用棉簽采皮膚損害處滲出物，（不加增菌肉湯）。

4.糞便與嘔吐物標(biāo)本：有消化道癥狀的采糞便或嘔吐物標(biāo)本，注意選取其中混有血液的部分。

5.痰與咽拭子標(biāo)本：有呼吸道癥狀的收集痰液及咽拭子標(biāo)本。

6.腦脊液標(biāo)本：表現(xiàn)腦膜刺激癥狀的病人，腰椎穿刺獲取腦脊液。

7.尸體標(biāo)本的采?。嚎赏ㄟ^穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實(shí)質(zhì)性臟器獲得組織標(biāo)本。

8.有病死動(dòng)物接觸史可采病死動(dòng)物標(biāo)本或相關(guān)土壤等環(huán)境標(biāo)本。（二）細(xì)菌分離培養(yǎng)：全部標(biāo)本均應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.標(biāo)本處理：在生物安全柜內(nèi)打開裝標(biāo)本的專用容器。在正常情況下應(yīng)該是無菌的標(biāo)本，如血液或腦脊液，直接涂布平板，每平板0.1ml左右，組織標(biāo)本應(yīng)先以無菌剪刀剪開一斷面，在培養(yǎng)基表面壓印，然后以接種環(huán)涂開。疑似病例的滲出液標(biāo)本，直接涂布平板后，剩余標(biāo)本可放入肉湯增菌液中增菌。土壤等有污染或陳舊的標(biāo)本，均首先制成懸液（土壤等標(biāo)本經(jīng)自然沉淀除去粗大沉淀物），10000轉(zhuǎn)／分鐘離心5分鐘，棄去大部分上清液，留少量液體與沉淀物混勻，沸水浴加熱15分鐘后，取適量涂布平板。

2.細(xì)菌分離培養(yǎng)：將上述處理過的標(biāo)本冷卻后，用移液器吸取0.1ml左右于固體培養(yǎng)基上，用接種環(huán)涂布均勻，在37℃孵育12-24h后，檢查是否長出可疑的炭疽芽胞桿菌菌落。

3.挑選可疑菌落：上述平板在37℃孵育12-24小時(shí)后，檢查是否長出可疑的炭疽芽胞桿菌菌落。炭疽芽胞桿菌菌落的形態(tài)為：灰白色、不透明、中等大小，常不規(guī)則，表面呈毛玻璃樣。如圖2示。圖2（三）涂片、G染色、莢膜染色、芽孢染色、光鏡檢查

1.在低倍鏡下觀察，可見菌落呈卷發(fā)狀，羊毛狀如圖3,4示。

2.革蘭氏染色陽性，細(xì)菌呈鏈狀排列，菌體兩端平齊，呈竹節(jié)狀圖5,6,7示。在機(jī)體內(nèi)或特殊培養(yǎng)條件下能形成莢膜，印度墨汁負(fù)染時(shí)可見菌體周圍有肥厚的莢膜，多色美蘭染色時(shí)菌體染成藍(lán)色、莢膜染成紅色。在固體培養(yǎng)基上，于大氣條件下可形成芽胞，芽胞體染不上顏色(革蘭氏)，位于細(xì)菌中央，呈卵圓形，不膨脹圖8示；石炭酸復(fù)紅染色，芽胞為紅色，菌體為藍(lán)色圖9示。圖3圖4圖5圖6圖7圖8圖9（四）噬菌體裂解和青霉素敏感性試驗(yàn)將上述可疑菌落挑出，劃線接種于平板之上，在劃線區(qū)內(nèi)一處滴一滴診斷用炭疽噬菌體，另一處貼一片青霉素紙片。37℃孵育8-24小時(shí)后，在滴噬菌體處有透明噬菌斑，青霉素紙片周圍有明顯的抑菌環(huán)（圖9）示，便可判定接種物為炭疽芽胞桿菌。在患者或尸體中分離獲得炭疽芽胞桿菌，炭疽的診斷即可確立。圖10（五）PCR基因檢測

1.PCR標(biāo)本處理：用于PCR模板制備的標(biāo)本類型有土壤，毛皮，臟器，組織標(biāo)本，棉拭子。（1）土壤標(biāo)本：用硬紙條對(duì)折取約0.1～0.3g土壤標(biāo)本置于1.5ml離心管中，加入蒸餾水或pH8.0的TE溶液至0.5ml，用移液器輕輕攪動(dòng)，使其懸浮，蓋嚴(yán)蓋子。（2）毛皮標(biāo)本：為避免毛皮受氣流影響飛到各處，在安全柜中放一個(gè)紙袋，在袋子中用無菌剪刀將毛皮標(biāo)本剪碎成小塊，取剪碎的標(biāo)本置于1.5ml離心管中，用移液器或吸管加入蒸餾水或pH8.0的TE溶液至0.5ml，蓋嚴(yán)蓋子。用過的剪刀、鑷子放入盛有消毒液的加蓋容器內(nèi)。（3）臟器（心、肝、脾、肺等），組織標(biāo)本：用無菌剪刀和鑷子約取1g標(biāo)本，放入研磨器中研磨，再加入0.5ml蒸餾水或pH8.0的TE溶液懸浮，混勻后，用移液器將液體部分移入1.5ml離心管中，蓋嚴(yán)。用過的容器及標(biāo)本碎塊放入可封閉容器中，剪刀、鑷子等放入盛有消毒液的加蓋容器內(nèi)。（4）棉拭子標(biāo)本：在棉拭子容器中加0.5ml蒸餾水或pH8.0的TE溶液，用無菌鑷子擠壓拭子幾次，用移液器或吸管吸液體放入1.5ml離心管中，蓋嚴(yán)。將以上放有標(biāo)本的離心管蓋子封好，100℃加熱20min。10000rpm離心10min，用注射器將上清液吸出，必要時(shí)應(yīng)用0.22μm濾器過濾除菌，濾液用一個(gè)新離心管收集即為模板。制備好的模板暫時(shí)不用時(shí)，要放在－20℃保存。

2.PCR操作程序：（1）所用引物序列如下：其中cap外和cap內(nèi)檢測的是同一個(gè)基因，可只使用一對(duì)。引物名稱序列基因定位擴(kuò)增長度（bp）pagA普F:ATTTGCGGTAACACTTCACTpagA基因－pXO1923R:AGACCGTGACAATGATGGAAcap外F：CCTGGTTGTTCTTTTCGTTGCcap基因－pXO21242R：CGGATTGTATATGGAGTGGGcap內(nèi)F：TTTCACCAGCACCCACATAGcap基因－pXO21002R：GGGACAGGAATGTTTGGATCrpoB普2F:CCAACAGTAGAAATGCCR:AATTTCACCAGTTTCTGGATCTrpoB基因－染色體197（2）反應(yīng)體系：在PCR管內(nèi)依次加入以下成分，反應(yīng)體系總共25ul，10×反應(yīng)緩沖液2.5μl4×dNTP混合物（每種2.5mM）2μl引物（上游）1μl引物（下游）1μl待測模板1μlTaqDNA聚合酶0.5μl（2-3U）無菌去離子水17μl使用2×mix的反應(yīng)體系：25μl2×mix12.5μl引物（上游）1μl引物（下游）1μl待測模板1μl無菌去離子水9.5μl

（3）反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5min；然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。（4）電泳：1%瓊脂糖凝膠熔化，稍涼后，加入核酸染料（100ml凝膠加入染料5ul），倒入模具中，插入梳子，待凝固后放入電泳槽內(nèi)，拔掉梳子。從擴(kuò)增好的PCR管內(nèi)吸取5ul與1ul6×loadingbuffer混勻后加入加樣孔內(nèi)，兩側(cè)孔內(nèi)加入5ulDNAMarker，100V，電泳1小時(shí)左右，在紫外透射儀或讀膠儀上觀察結(jié)果。

（5）結(jié)果分析：圖10示。pagA擴(kuò)增結(jié)果，片段長度為923bpcap內(nèi)擴(kuò)增結(jié)果，片段長度為1002bpcap外擴(kuò)增結(jié)果，片段長度為1242bprpoB2擴(kuò)增結(jié)果，片段長度為197bp圖11（六）菌種保存

1.50%甘油液保存：在固體培養(yǎng)基表面，于37℃培養(yǎng)4天以上，應(yīng)有70%以上可形成芽胞。用磷酸鹽緩沖液洗下培養(yǎng)物，根據(jù)混濁度配制成約每毫升2×109個(gè)細(xì)菌的懸液，加入等量的滅菌甘油后，分裝入2ml螺口菌種管內(nèi)，每管1ml。每株菌至少應(yīng)制備2支，記錄制備支數(shù)。將菌種管置于菌種保藏盒中，4℃保存。

2.半固體保存：從培養(yǎng)一天的固體培養(yǎng)基上用接種針挑取細(xì)菌，穿刺半固體培養(yǎng)管，37℃過夜培養(yǎng)，第二天取出，在半固體表面滴加一滴滅菌甘油。每株菌至少應(yīng)制備2支，記錄制備支數(shù)。將菌種管置于菌種保藏盒中，4℃保存。

3.菌種保存管保存：從培養(yǎng)兩天以上的固體培養(yǎng)基上用接種環(huán)挑取細(xì)菌，加入菌種保存管中，混勻，去掉適量液體，做好標(biāo)記，置于菌種保藏盒中，-80℃保存。每株菌至少應(yīng)制備2支，記錄制備支數(shù)。六、炭疽實(shí)驗(yàn)室防護(hù)和實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)在炭疽桿菌的研究、檢測中，特別要求注意“控制”