炭疽實驗室檢測技術(shù)-楊發(fā)蓮

炭疽實驗室檢測技術(shù)

云南省地方病防治所

楊發(fā)蓮

目錄一、前言二、炭疽病原檢驗程序三、血清中炭疽抗體水平檢測四、實驗項目五、實驗方法六、炭疽實驗室防護和實驗操作注意事項一、前言炭疽桿菌屬芽胞桿菌科（Bacillaceae），需氧芽胞桿菌屬（Bacillus），是最大的一類細菌（寬1~3μm，長5~8μm）。最佳生長溫度37℃（12~45℃），最佳生長pH為7.0~7.4。細胞結(jié)構(gòu)中有特點的是其多聚谷氨酸莢膜（poly-γ-D-glutamicacid，PGA），無鞭毛。炭疽桿菌的毒力因素主要是外毒素（保護性抗原PA、致死因子LF和水腫因子EF）三組分和莢膜，并分別由它僅含的兩個毒性質(zhì)粒（pX01，pX02）分別編碼和控制，失去任何一個質(zhì)粒因此也就失去其中一個毒力因素的炭疽桿菌就變成了難以致病的弱毒株。炭疽是由炭疽桿菌所引起的一種危害嚴重的人畜共患傳染病，若控制不及時就會引起大批的牲畜死亡造成重大的經(jīng)濟損失，嚴重影響人、畜健康和生產(chǎn)力發(fā)展。隨著我國市場經(jīng)濟的發(fā)展，人民生活需求的提高，飼養(yǎng)畜密度的增加，動物性食品和毛、皮革制品的利用日趨普及，以及土地資源的開發(fā)和環(huán)境的改造，各類物資的頻繁交流，炭疽對我國人民生命安全和財產(chǎn)構(gòu)成很大威脅，如不采取及時、有效的監(jiān)控措施，炭疽發(fā)病勢將有增無減，隱患無窮。鑒于此種傳染性疾病在我國仍屬一種高、危病種，加以它尚有自外輸入我國的潛在可能，在今后加速發(fā)展市場經(jīng)濟的的新形勢下，加強各級領(lǐng)導(dǎo)對炭疽防制工作的重視和支持，提高廣大的基層相關(guān)工作人員對炭疽的認識和防病能力，是很有必要的。要做到早發(fā)現(xiàn)、早治療、早控制，必須有相關(guān)豐富的流行病學(xué)和臨床知識外，一定要熟練掌握相關(guān)的實驗室檢測技術(shù)。二、炭疽病原檢驗程序

圖1示。

三、血清中炭疽抗體水平檢測（一）意義人血清中炭疽抗體水平檢測的意義主要在于下列幾個方面：正常人群血清炭疽抗體水平資料收集，特殊人群（產(chǎn)業(yè)工人、畜牧人員、實驗室人員）血清炭疽抗體水平觀察，疫苗接種人群血清炭疽抗體水平分析，患病人群血清炭疽抗體水平研究，在患者標(biāo)本中未獲得炭疽芽胞桿菌陽性檢測和分離結(jié)果的情況下，血清抗炭疽特異性抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上升高也可以結(jié)合流行病學(xué)線索和臨床表現(xiàn)進行確診。（二）檢測方法目前均為酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

1.標(biāo)本的采集和保存：發(fā)病初期和恢復(fù)期（發(fā)病后15天左右）各采一次血，血清采集時應(yīng)盡量避免溶血，因紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾讀取方法的結(jié)果，可造成假陽性，長菌的標(biāo)本同樣的道理易產(chǎn)生假陽性；抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑；標(biāo)本在冰箱中保存時間過長易導(dǎo)致血清IgG聚合，使試劑本底加深，一般血清置4℃冰箱5天內(nèi)完成測試，如需保存一周以上則要-20℃冰凍保存，融解時應(yīng)上下顛倒充分混勻，同時避免氣泡。

2.注意事項：ELISA實驗的結(jié)果受操作影響很大，每個步驟包括加樣、溫育、洗滌、顯色、酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認真負責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏、強特異的優(yōu)點。因此，應(yīng)建立實驗項目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)。報告方式以定量分析結(jié)果的滴度單位表示；檢測時應(yīng)以接種疫苗前或初報告病例地方的人或動物的血清作為陰性血清，如有可能也可設(shè)陽性血清對照。陰性血清每次都要和待測標(biāo)本同時做。（三）具體程序

1.包被抗原：用包被緩沖液將已知抗原稀釋至0.3μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。洗滌緩沖液配方為：Tris2.42克，1mol/LHCI13mL,吐溫-20（0.05%）0.5mL,加蒸餾水至1000mL。

2.待檢血清反應(yīng)：加1:8稀釋(稀釋液為生理鹽水)的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育60分鐘，洗滌3次，每次3分鐘。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)

3.酶標(biāo)抗體反應(yīng)：于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)或SPA0.1ml，37℃孵育60分鐘，洗滌3次，每次3分鐘。

4.顯色反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入等體積混合的顯色底物A、B溶液0.1ml，37℃20分鐘。底物A液（磷酸鹽枸櫞酸緩沖液，pH5.0）配方為：0.2mol/LNa2HPO4(28.4g/L)25.7mL,0.1mol/L枸櫞酸(19.2g/L)24.3mL,H2O20.1%,蒸餾水50mL。底物B液[TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液]配方為：TMB3.90g,枸櫞酸10.52g,EDTA1.86g,甘油2000mL,DMSO300mL,加熱溶解后加蒸餾水至10000mL。

5.終止顯色：于各反應(yīng)孔中加入顯色終止液(0.5mol/LH2SO4)0.1mL終止反應(yīng)。

6.結(jié)果判定：實驗結(jié)果用酶標(biāo)儀判讀，被檢孔OD值達陰性血清對照孔OD值的2.1倍時，始可判為陽性。四、實驗項目（一）標(biāo)本采集（二）細菌培養(yǎng)（三）涂片、G染色、莢膜染色、芽孢染色、光鏡檢查（四）噬菌體裂解和青霉素敏感性試驗（五）PCR基因檢測（六）菌種保存五、實驗方法（一）標(biāo)本采集

1.采集標(biāo)本時應(yīng)遵循的原則:盡可能在抗生素治療開始前采集標(biāo)本，除必要時并在具備操作病毒細菌條件的實驗室內(nèi)，不得用解剖的方式獲得標(biāo)本。所需的血液與組織標(biāo)本，均應(yīng)以穿刺方式取得。所有標(biāo)本均置無菌容器中

2.血液標(biāo)本：所有疑似病例，采取血液標(biāo)本5-10ml（不加抗凝劑）。

3.皮膚損害處標(biāo)本：玻片直接在皮膚破損處壓蘸；再用棉簽采皮膚損害處滲出物，（不加增菌肉湯）。

4.糞便與嘔吐物標(biāo)本：有消化道癥狀的采糞便或嘔吐物標(biāo)本，注意選取其中混有血液的部分。

5.痰與咽拭子標(biāo)本：有呼吸道癥狀的收集痰液及咽拭子標(biāo)本。

6.腦脊液標(biāo)本：表現(xiàn)腦膜刺激癥狀的病人，腰椎穿刺獲取腦脊液。

7.尸體標(biāo)本的采取：可通過穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實質(zhì)性臟器獲得組織標(biāo)本。

8.有病死動物接觸史可采病死動物標(biāo)本或相關(guān)土壤等環(huán)境標(biāo)本。（二）細菌分離培養(yǎng)：全部標(biāo)本均應(yīng)進行細菌分離培養(yǎng)。

1.標(biāo)本處理：在生物安全柜內(nèi)打開裝標(biāo)本的專用容器。在正常情況下應(yīng)該是無菌的標(biāo)本，如血液或腦脊液，直接涂布平板，每平板0.1ml左右，組織標(biāo)本應(yīng)先以無菌剪刀剪開一斷面，在培養(yǎng)基表面壓印，然后以接種環(huán)涂開。疑似病例的滲出液標(biāo)本，直接涂布平板后，剩余標(biāo)本可放入肉湯增菌液中增菌。土壤等有污染或陳舊的標(biāo)本，均首先制成懸液（土壤等標(biāo)本經(jīng)自然沉淀除去粗大沉淀物），10000轉(zhuǎn)／分鐘離心5分鐘，棄去大部分上清液，留少量液體與沉淀物混勻，沸水浴加熱15分鐘后，取適量涂布平板。

2.細菌分離培養(yǎng)：將上述處理過的標(biāo)本冷卻后，用移液器吸取0.1ml左右于固體培養(yǎng)基上，用接種環(huán)涂布均勻，在37℃孵育12-24h后，檢查是否長出可疑的炭疽芽胞桿菌菌落。

3.挑選可疑菌落：上述平板在37℃孵育12-24小時后，檢查是否長出可疑的炭疽芽胞桿菌菌落。炭疽芽胞桿菌菌落的形態(tài)為：灰白色、不透明、中等大小，常不規(guī)則，表面呈毛玻璃樣。如圖2示。圖2（三）涂片、G染色、莢膜染色、芽孢染色、光鏡檢查

1.在低倍鏡下觀察，可見菌落呈卷發(fā)狀，羊毛狀如圖3,4示。

2.革蘭氏染色陽性，細菌呈鏈狀排列，菌體兩端平齊，呈竹節(jié)狀圖5,6,7示。在機體內(nèi)或特殊培養(yǎng)條件下能形成莢膜，印度墨汁負染時可見菌體周圍有肥厚的莢膜，多色美蘭染色時菌體染成藍色、莢膜染成紅色。在固體培養(yǎng)基上，于大氣條件下可形成芽胞，芽胞體染不上顏色(革蘭氏)，位于細菌中央，呈卵圓形，不膨脹圖8示；石炭酸復(fù)紅染色，芽胞為紅色，菌體為藍色圖9示。圖3圖4圖5圖6圖7圖8圖9（四）噬菌體裂解和青霉素敏感性試驗將上述可疑菌落挑出，劃線接種于平板之上，在劃線區(qū)內(nèi)一處滴一滴診斷用炭疽噬菌體，另一處貼一片青霉素紙片。37℃孵育8-24小時后，在滴噬菌體處有透明噬菌斑，青霉素紙片周圍有明顯的抑菌環(huán)（圖9）示，便可判定接種物為炭疽芽胞桿菌。在患者或尸體中分離獲得炭疽芽胞桿菌，炭疽的診斷即可確立。圖10（五）PCR基因檢測

1.PCR標(biāo)本處理：用于PCR模板制備的標(biāo)本類型有土壤，毛皮，臟器，組織標(biāo)本，棉拭子。（1）土壤標(biāo)本：用硬紙條對折取約0.1～0.3g土壤標(biāo)本置于1.5ml離心管中，加入蒸餾水或pH8.0的TE溶液至0.5ml，用移液器輕輕攪動，使其懸浮，蓋嚴蓋子。（2）毛皮標(biāo)本：為避免毛皮受氣流影響飛到各處，在安全柜中放一個紙袋，在袋子中用無菌剪刀將毛皮標(biāo)本剪碎成小塊，取剪碎的標(biāo)本置于1.5ml離心管中，用移液器或吸管加入蒸餾水或pH8.0的TE溶液至0.5ml，蓋嚴蓋子。用過的剪刀、鑷子放入盛有消毒液的加蓋容器內(nèi)。（3）臟器（心、肝、脾、肺等），組織標(biāo)本：用無菌剪刀和鑷子約取1g標(biāo)本，放入研磨器中研磨，再加入0.5ml蒸餾水或pH8.0的TE溶液懸浮，混勻后，用移液器將液體部分移入1.5ml離心管中，蓋嚴。用過的容器及標(biāo)本碎塊放入可封閉容器中，剪刀、鑷子等放入盛有消毒液的加蓋容器內(nèi)。（4）棉拭子標(biāo)本：在棉拭子容器中加0.5ml蒸餾水或pH8.0的TE溶液，用無菌鑷子擠壓拭子幾次，用移液器或吸管吸液體放入1.5ml離心管中，蓋嚴。將以上放有標(biāo)本的離心管蓋子封好，100℃加熱20min。10000rpm離心10min，用注射器將上清液吸出，必要時應(yīng)用0.22μm濾器過濾除菌，濾液用一個新離心管收集即為模板。制備好的模板暫時不用時，要放在－20℃保存。

2.PCR操作程序：（1）所用引物序列如下：其中cap外和cap內(nèi)檢測的是同一個基因，可只使用一對。引物名稱序列基因定位擴增長度（bp）pagA普F:ATTTGCGGTAACACTTCACTpagA基因－pXO1923R:AGACCGTGACAATGATGGAAcap外F：CCTGGTTGTTCTTTTCGTTGCcap基因－pXO21242R：CGGATTGTATATGGAGTGGGcap內(nèi)F：TTTCACCAGCACCCACATAGcap基因－pXO21002R：GGGACAGGAATGTTTGGATCrpoB普2F:CCAACAGTAGAAATGCCR:AATTTCACCAGTTTCTGGATCTrpoB基因－染色體197（2）反應(yīng)體系：在PCR管內(nèi)依次加入以下成分，反應(yīng)體系總共25ul，10×反應(yīng)緩沖液2.5μl4×dNTP混合物（每種2.5mM）2μl引物（上游）1μl引物（下游）1μl待測模板1μlTaqDNA聚合酶0.5μl（2-3U）無菌去離子水17μl使用2×mix的反應(yīng)體系：25μl2×mix12.5μl引物（上游）1μl引物（下游）1μl待測模板1μl無菌去離子水9.5μl

（3）反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5min；然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。（4）電泳：1%瓊脂糖凝膠熔化，稍涼后，加入核酸染料（100ml凝膠加入染料5ul），倒入模具中，插入梳子，待凝固后放入電泳槽內(nèi)，拔掉梳子。從擴增好的PCR管內(nèi)吸取5ul與1ul6×loadingbuffer混勻后加入加樣孔內(nèi)，兩側(cè)孔內(nèi)加入5ulDNAMarker，100V，電泳1小時左右，在紫外透射儀或讀膠儀上觀察結(jié)果。

（5）結(jié)果分析：圖10示。pagA擴增結(jié)果，片段長度為923bpcap內(nèi)擴增結(jié)果，片段長度為1002bpcap外擴增結(jié)果，片段長度為1242bprpoB2擴增結(jié)果，片段長度為197bp圖11（六）菌種保存

1.50%甘油液保存：在固體培養(yǎng)基表面，于37℃培養(yǎng)4天以上，應(yīng)有70%以上可形成芽胞。用磷酸鹽緩沖液洗下培養(yǎng)物，根據(jù)混濁度配制成約每毫升2×109個細菌的懸液，加入等量的滅菌甘油后，分裝入2ml螺口菌種管內(nèi)，每管1ml。每株菌至少應(yīng)制備2支，記錄制備支數(shù)。將菌種管置于菌種保藏盒中，4℃保存。

2.半固體保存：從培養(yǎng)一天的固體培養(yǎng)基上用接種針挑取細菌，穿刺半固體培養(yǎng)管，37℃過夜培養(yǎng)，第二天取出，在半固體表面滴加一滴滅菌甘油。每株菌至少應(yīng)制備2支，記錄制備支數(shù)。將菌種管置于菌種保藏盒中，4℃保存。

3.菌種保存管保存：從培養(yǎng)兩天以上的固體培養(yǎng)基上用接種環(huán)挑取細菌，加入菌種保存管中，混勻，去掉適量液體，做好標(biāo)記，置于菌種保藏盒中，-80℃保存。每株菌至少應(yīng)制備2支，記錄制備支數(shù)。六、炭疽實驗室防護和實驗操作注意事項在炭疽桿菌的研究、檢測中，特別要求注意“控制”