第七章微生物的遺傳變異和育種

菌種的衰退、復(fù)壯和保藏Microbiology

Microbiology

性狀穩(wěn)定的菌種生產(chǎn)或科研正常進行的前提：這是微生物學工作最重要的基本要求Microbiology

一、菌種的衰退與復(fù)壯微生物的突變率10-10~10-5正變體（plusmutant）負變體（minusmutant）Microbiology

1.衰退的定義

衰退（degeneration）是指由于自發(fā)突變的結(jié)果，使某物種原有一系列生物學性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。微生物細胞群

量變微生物細胞群

質(zhì)變菌種的衰退逐步演化過程Microbiology

菌種原有的典型性狀變得不典型時就稱菌種退化，這種變異也稱負變（minusmutation）。Microbiology

2.衰退的具體表現(xiàn)①原有形態(tài)性狀變得不典型了；②生長速度變慢，產(chǎn)生的孢子變少；③代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降，即出現(xiàn)負變；④致病菌對宿主侵染力的下降；⑤對外界不良條件的抵抗能力下降。Microbiology

3.衰退的原因造成菌種退化的主要原因是基因突變。誤區(qū)生產(chǎn)工藝條件控制不當雜菌污染造成生產(chǎn)性能

下降飾變Microbiology

（一）衰退的防止（1）選育生產(chǎn)性能穩(wěn)定的菌株作為生產(chǎn)菌株（2）控制傳代次數(shù)（3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件（4）利用不易衰退的細胞傳代（5）采用有效的菌株保藏方法Microbiology

（1）選育生產(chǎn)性能穩(wěn)定的菌株作為生產(chǎn)菌株經(jīng)誘變等處理后的菌種要連續(xù)傳代、分離純化，防止分離回復(fù)。誘變處理Microbiology

（2）控制傳代次數(shù)盡量避免不必要的移種和傳代，將必要的傳代降到最低限度，減少自發(fā)突變幾率。Microbiology

（3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造一個適合原種的生長條件，就可在一定程度上防止菌種衰退。例如，給予營養(yǎng)缺陷型適當?shù)臓I養(yǎng)必需成分，可降低回復(fù)突變頻率。Microbiology

（4）利用不易衰退的細胞傳代放線菌和霉菌一般用單核的孢子接種，菌絲細胞常含有幾個細胞核，甚至是由異核體組成的，用于接種就易出現(xiàn)離異（dissociation）或。

例如衰退，構(gòu)巢曲霉如用分生孢子接種易退化，用子囊孢子接種不易退化。Microbiology

（5）采用有效的菌株保藏方法菌種保藏的溫度、所用的培養(yǎng)等可影響自發(fā)突變。

菌種保藏的重要性Microbiology

（二）菌種的復(fù)壯（rejuvenation）狹義的復(fù)壯：廣義的復(fù)壯：一種消極的措施一種積極的措施Microbiology

狹義的復(fù)壯：是指菌種已發(fā)生衰退后，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標、從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體、以達到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。是一種消極的措施Microbiology

長久保存的菌種在啟用時，要經(jīng)移種至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，待生長后再行接種，如此連續(xù)2-3次，甚至多次，直至出現(xiàn)典型的形態(tài)和生活特征為止。Microbiology

廣義的復(fù)壯：在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測定工作；以期從中選擇到自發(fā)的正交個體。是一項積極的措施Microbiology

復(fù)壯的方法：1.純種分離法（purecultureisolation）2.通過宿主復(fù)壯3.淘汰已衰退的個體Microbiology

1.純種分離法（purecultureisolation）通過純種分離把退化菌種的細胞群中仍保持原有典型性狀的單細胞分離出來，擴大培養(yǎng)，就可恢復(fù)正常。

通過純種分離把正變細胞分離出來，擴大培養(yǎng)，就可提高產(chǎn)量。Microbiology

純種分離的方法“菌落純”水平（purecultureincolonylever）

“菌株純”水平（purecultureinstrainlever）粗放精細平板表面涂布法平板劃線分離法瓊脂培養(yǎng)基澆注法用“分離小室”進行單細胞分離用顯微操縱器進行單細胞分離用菌絲尖端切割法進行單細胞分離菌落純（菌種純）細胞純（菌株純）純種分離法激光鑷子技術(shù)Microbiology

（1）平板表面涂布法將適量待分離菌懸液加到平板上，用涂棒涂布均勻，培養(yǎng)。單菌落達到分離目的。Microbiology

（2）平板劃線分離法

接種環(huán)沾取少許待分離菌種，在平板表面進行連續(xù)劃線，細胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，逐步分散，經(jīng)培養(yǎng)后，得到單菌落。Microbiology

平板劃線分離單菌落Microbiology

（3）用顯微操縱器進行單細胞分離在顯微鏡下使用單孢子分離器進行機械操作，挑取單孢子或單細胞進行培養(yǎng)。Microbiology

Microbiology

（4）激光鑷子技術(shù)

激光能捕獲微小粒子，因此在它移動時就會像鑷子一樣，“夾”著微小粒子移動?？茖W家把這種現(xiàn)象稱為“激光鑷子”。

現(xiàn)在生物學家已能用激光鑷子夾住單個細胞。

例如，從血液中分離出單個血紅細胞用于研究。Microbiology

2.通過宿主復(fù)壯針對病原菌衰退的病原菌相應(yīng)的昆蟲或動、植物宿主體內(nèi)從典型的病灶部分分離到恢復(fù)毒力的復(fù)壯菌株多次選擇接種活的“選擇性培養(yǎng)基”Microbiology

3.淘汰已衰退的個體細黃鏈霉菌（S.microflavus）

“5406”農(nóng)用抗生菌的分生孢子，采用-10℃~-30℃的低溫處理5~7d，退化的個體死亡，留下10~20%個體是為退化的，從而達到復(fù)壯的效果。Microbiology

二、菌種的保藏菌種（culture,stockculture）是一種極其重要和珍貴的生物資源！菌種保藏（preservation,conservation,naintenance）是一項十分重要的基礎(chǔ)工作。Microbiology

國家設(shè)立專門的菌種保藏機構(gòu)任務(wù)：廣泛收集實驗室和生產(chǎn)用菌種、菌株、病毒毒株（有時還包括動、植物的細胞株和微生物質(zhì)粒等），并將它們妥善保藏，使之不死、不衰、不亂，便于研究、交換和使用。Microbiology

1.菌種保藏的原理（1）挑選典型菌種的優(yōu)良純種，

最好用芽孢或孢子等休眠體。（2）創(chuàng)造一個有利于長期休眠的環(huán)境條件，

干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)等。（3）添加保護劑或酸度中和劑，

避免保藏過程中細胞受傷。Microbiology

干燥和低溫時菌種保藏中的最重要因素（1）較低的溫度更有利于保藏

液氮（-195℃）＞

低溫冰箱（-70℃）＞

普通冰箱冷凍（-20℃）＞

普通冰箱冷藏（4℃）Microbiology

（2）水分在低溫下形成冰晶，破壞細胞結(jié)構(gòu)加入保護劑：0.5mol/L左右的甘油或二甲亞砜；海藻糖、脫脂牛奶、血清白蛋白、糊精或聚乙烯比咯烷酮（PVP）等。Microbiology

（3）介質(zhì)減少冷凍對細胞損傷的機制作用機理：0.5mol/L左右的甘油或二甲亞砜可透入細胞，并通過降低強烈的脫水左右而保護細胞；

作用機理：大分子物質(zhì)如海藻糖、脫脂牛奶、血清白蛋白、糊精或聚乙烯比咯烷酮雖不透入細胞，但可通過與細胞結(jié)合的方式而防止細胞膜受凍傷。Microbiology

2.菌種保藏的方法一種良好的菌種保藏方法保持原菌的優(yōu)良性狀長期穩(wěn)定方法的通用性操作的簡便性設(shè)備的普及性Microbiology

Microbiology

常見菌種保藏方法（1）定期移植保藏法（2）液體石蠟保藏法（3）甘油懸液保藏法（4）砂土保藏法（5）冷凍干燥保藏法（6）液氮保藏法Microbiology

（1）定期移植保藏法操作方法：①將菌種接種在液體、斜面或穿刺在半固體培養(yǎng)基上②生長完全③放置密封盒中，普通冰箱4℃保藏，

相對濕度50%~70%以下；或培養(yǎng)物用無菌脫脂牛奶—保護劑制成菌懸液加入菌種瓶中，-80℃保藏。Microbiology

保種機制：（1）低溫可減緩生長速度，（2）通氣不良，（3）有限的營養(yǎng)。保藏時間：一般4~6個月必須傳代一次保藏種類：各大類微生物Microbiology

定期移植保藏法優(yōu)點：操作簡便，不受條件限制，各類生物均可。缺點：時間段，傳代多，易退化。Microbiology

（2）液體石蠟保藏法操作方法：①將菌種接種斜面培養(yǎng)基上，②生長完全后，在斜面上覆蓋無菌的液體石蠟，液面高于斜面1cm，③放于普通冰箱4℃保藏。Microbiology

保種機制：（1）石蠟可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，（2）石蠟可隔氧，（3）低溫可減緩生長速度，（4）通氣不良（5）有限的營養(yǎng)。保藏時間：1~2年保藏種類：除石蠟發(fā)酵微生物外，各大類微生物均可Microbiology

液體石蠟保藏法優(yōu)點：操作簡便，不受條件限制，各類生物均可。缺點：時間段，傳代多，易退化、不能保存石蠟微生物。注意：石蠟的純度

致病菌Microbiology

（3）砂土保藏法操作方法：①將砂和土用酸浸泡去除其中的有機質(zhì)，②洗滌中和，干燥，③分裝于安瓶內(nèi)、加塞滅菌，④把健壯的孢子懸液滴于砂土中攪拌均勻，⑤真空干燥后封口，⑥置于干燥器或4℃冰箱中保存。Microbiology

保種機制：（1）砂土營養(yǎng)貧乏，（2）真空干燥去除水分和氧，（3）低溫可減緩生長速度，（4）通氣不良保藏時間：1~10年保藏種類：產(chǎn)孢子的微生物Microbiology

砂土保藏法優(yōu)點：低溫、干燥、無氧、無營養(yǎng)，保藏效果好，時間可達幾年至數(shù)十年。缺點：只適用于產(chǎn)孢子的微生物，不能用于保藏營養(yǎng)細胞。Microbiology

（4）冷凍干燥保藏法將液體樣品（含保護劑的菌態(tài)液）在凍結(jié)狀態(tài)下升華其中的水分，最后達到干燥。

培養(yǎng)物用無菌脫脂牛奶—保護劑制成菌懸液，加入安瓶中，冷凍、抽真空、封口。Microbiology

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冷凍干燥保藏法優(yōu)點：低溫、干燥、無氧、無營養(yǎng)，有保護劑，可保藏各大類微生物，保藏時間可達幾十年，是目前使用最廣、最有效的保藏方法。一般專業(yè)機構(gòu)大都使用此法保藏。缺點：不能保藏真菌菌絲。Microbiology

（5）液氮保藏法操作方法：液氮溫度可達-196℃，把菌懸液密封于安瓶中，置液氮罐內(nèi)保藏。Microbiology

液氮保藏法優(yōu)點：保藏效果好。缺點：價格昂貴。Microbiology

（6）基因工程菌保藏攜帶外源基因的重組質(zhì)粒通常是不穩(wěn)定的，容易丟失，一般情況下，細胞丟失了質(zhì)粒，生長會加快?；蚬こ痰谋２厥抢迷诳剐耘囵B(yǎng)基中只有含重組質(zhì)粒的細胞才能生長的原理設(shè)計的。Microbiology

例如，質(zhì)粒pBR322中含有Ampr和Tetr，外源DNA插入到Tetr，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli中，在培養(yǎng)基中加入Ampicillin（氨芐青霉素）選出重組質(zhì)粒細胞Ampicillin+Tetracyclin（四環(huán)素），即可選出含有質(zhì)粒pBR322的細胞。Microbiology

不同的微生物需要不同的保藏方法。

沒有一種保藏方法能適宜所有的微生物。

選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特

性、保藏物的使用特點及現(xiàn)有條件等進行綜

合考慮。

重要的菌株，要盡可能多的采用各種不同的手段進行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌株的喪失。Microbiology

不同保藏方法比較Microbiology

三、菌種保藏機構(gòu)（一）國內(nèi)1978年7月，中國微生物菌中保藏管理委員會（CCCCM）在北京成立。Microbiology

下設(shè)六個全國性菌種保藏管理中心1.普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC中科院微生物研究所(AS)：細菌、真菌中科院武漢病毒研究所(AS-IV)：病毒2.農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心ACCC中國農(nóng)科院3.工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC輕工部食品發(fā)酵工業(yè)科學研究所(IFFI)Microbiology

4.醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心CMCC衛(wèi)生部藥品生物檢定所(ID)：細菌中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所(NICPBP)：真菌中國醫(yī)學科學院病毒研究所：病毒5.抗生素菌種