過氧化氫酶(CAT)活性的測定

過氧化氫酶(CAT)活性的測定過氧化氫酶（CAT）活性的測定：紫外吸收法目的與要求：測定植物中過氧化氫酶的活性，了解其與植物代謝強度、抗寒、抗病能力的關(guān)系。原理：過氧化氫酶是一種含鐵的血紅蛋白酶，能催化過氧化氫分解為水和分子氧，并在此過程中起傳遞電子的作用。過氧化氫既是氧化劑又是還原劑，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。在240nm波長下，過氧化氫有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液的吸光度（A240）隨反應(yīng)時間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。材料、儀器設(shè)備及試劑：材料：小麥或其他葉片。儀器設(shè)備：研缽、紫外分光光度計、離心機、恒溫水浴、容量瓶。試劑：0.2mol/LpH7.8磷酸緩沖液、0.1mol/LH2O2（30%的H2O2溶液稀釋至1000ml）。實驗步驟：1.酶液提?。喝⌒迈r植物葉片或其他組織0.5g，加入2-3ml4℃下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?，將容量瓶置5℃冰箱中靜置10min，取上清液在4000r/min下離心15min，上清液即為過氧化氫粗提液，5℃下保存?zhèn)溆谩?.測定：準(zhǔn)備3支試管，其中2支為樣品測定管，1支為空白管。按表1-1順序加入試劑。25℃預(yù)熱后，逐管加入0.6ml0.1mol/L的H2O2，每加完1管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，260nm下測定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測4min，待3支管全部測完后，按式（1-1）計算酶活性。表1-1：紫外吸收法測H2O2樣品測定液配制表管號粗酶液（ml）pH7.8磷酸緩沖液（ml）蒸餾水（ml）S10.43.02.0S20.43.02.0S00.4（失活酶液）3.02.0空白0.4（磷酸緩沖液）3.02.0結(jié)果計算方法如下：在1分鐘內(nèi)，如果A240減少了0.1，則表示酶量減少了1個酶活單位（μ）。過氧化氫酶活性（μ.g-1min-1）=ΔA240*Vt/(0.1*Vl*FW)。其中ΔA240表示加入失活酶液的對照管吸光值和樣品管吸光值的平均值。Vt表示粗酶提取液的總體積（ml），Vl表示測定時所用的粗酶提取液的體積（ml），F(xiàn)W表示樣品的鮮重（g），0.1表示A240每下降0.1就表示酶活單位（μ）減少1個。t表示過氧化氫到最后一次讀數(shù)時的時間（min）。為了計算過氧化氫酶活性，需要按照以下步驟進(jìn)行操作。首先，在1分鐘內(nèi)，如果A240減少了0.1，則表示酶量減少了1個酶活單位（μ）。其次，計算ΔA240，即加入失活酶液的對照管吸光值和樣品管吸光值的平均值。接下來，根據(jù)公式過氧化氫酶活性（μ.g-1min-1）=ΔA240*Vt/(0.1*Vl*FW)進(jìn)行計算。其中，Vt表示粗酶提取液的總體積（ml），Vl表示測定時所用的粗酶提取液的體積（ml），F(xiàn)W表示樣