《RNA剪切加工》課件

第6章

RNA剪切加工1精選課件ppt本次內容1、轉錄后加工2、RNA剪切3、真核生物與原核生物mRNA比較2精選課件ppt轉錄后加工

多數(shù)轉錄的初始產物無生物活性，在生物體內進行加工處理后才具有生物活性。轉錄后加工（post-transcriptionalmodification）（post-transcriptionalprocessing）:是指將各種前體RNA分子加工轉變成有功能的、成熟的各種RNA(mRNA、rRNA或tRNA等)的過程

3精選課件ppt加工的三種形式是：

①減少部分片段：如切除5’端前導序列，3’端尾巴和中部的內含子；

②增加部分片段：5’加帽,3’加ploy(A)和通過編輯加入一些堿基；

③修飾：對某些堿基進行甲基化等4精選課件ppt原核生物tRNA和rRNA加工真核生物tRNA和rRNA加工1.1tRNA和rRNA的加工5精選課件ppt1.1.1tRNA加工原核生物tRNA初始轉錄本有三種（1）多數(shù)為串連在一起的多順反（polycistron）（2）少數(shù)為單順反子（3）由tRNA和rRNA串連組成原核生物tRNA和rRNA的加工6精選課件ppt7精選課件ppt原核生物有兩種類型的tRNA基因：

1、具CCA序列——Ⅰ型tRNA

CCA下游仍有一段序列，需在酶的作用下切除

2、無CCA序列——Ⅱ型tRNA

需在酶的作用下添加CCA序列8精選課件ppt9精選課件ppt10精選課件ppt（1）RNaseP(由蛋白質和RNA組成的復合體)可切除E.coli前體tRNA5’的前導序列（41nt）。該酶不識別特殊的序列，而是識別二級結構——發(fā)夾所組成的tRNA。（2）去尾，形成3’－OH末端。由內切酶和外切酶共同參與。11精選課件ppt（3）修飾。在前體的一些專一部位的堿基需要通過甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等的作用進行修飾成為特殊的堿基。12精選課件ppt2.rRNA的加工

在E.coli中rRNA有7個轉錄單位,每個轉錄單位含有16S、23S、5SrRNA及一個或幾個tRNA。

rRNA前體的加工由RNaseⅢ負責。13精選課件ppt14精選課件ppt15精選課件ppt16精選課件ppt真核生物tRNA和rRNA的加工1.tRNA的加工

真核tRNA的基因與原核不同：

1）真核的前體分子tRNA數(shù)目多、單順反子、成簇排列、有基因間隔區(qū)。例如：爪蟾tRNA基因數(shù)目＞200拷貝，酵母約有400個tRNA基因，是一種重復序列；

2）真核的前體分子tRNA中含有內含子。其加工過程要剪接內含子，都要加CCA

17精選課件ppt18精選課件ppt酵母tRNA前體的體外剪接在未處理前電泳只出現(xiàn)一條帶加入核酸內切酶出現(xiàn)兩條帶19精選課件ppttRNA半分子tRNA半分子20精選課件ppt21精選課件ppt真核tRNA內含子的切除和其他內含子的切除是不同的：

1）沒有交界序列，沒有內部引導序列;

2）切除是依賴于蛋白質的RNase;3）不是轉酯反應；

4）其剪切原則上是依賴于對tRNA共同的二級結構的識別。22精選課件ppt23精選課件ppt

2.真核rRNA的加工

真核生物的18S、5.8S和28SrRNA基因串聯(lián)在一起形成一個轉錄本，初級轉錄本為45S前體，5SRNA與它們分開轉錄，這和原核的rRNA基因不同。

1）真核rRNA基因中沒有內含子。

2）在轉錄時或轉錄后有110個甲基化酶立即結合導轉錄本上：保持到rRNA加工成熟。18SRNA結合39個甲基化酶（胞質中加上4個）28SRNA結合74個甲基化酶表明甲基化用于標明轉錄本的加工區(qū)域24精選課件ppt25精選課件ppt26精選課件ppt1.2前體mRNA的加工1.2.1原核前體mRNA的加工1.2.2真核前體mRNA的加工27精選課件ppt1.2.1原核前體mRNA的加工

原核生物的mRNA一般不經(jīng)過加工，由于轉錄和翻譯偶聯(lián)，中間沒有加工的時間。少數(shù)情況：多順反子mRNA先被內切酶切成較小的單位再作為翻譯的模板。

28精選課件ppt29精選課件ppt1.2.2真核mRNA的加工

真核mRNA的加工一般要經(jīng)過四個步驟：

1）mRNA的5’端加帽

2）mRNA的3’端多聚腺苷酸化（加尾）

3）切除內含子

4）修飾（對某些堿基進行甲基化）30精選課件ppt1.2.2.1

mRNA的5'加帽成熟的真核生物并沒有游離的5’端，只有所謂的帽子結構，該結構是通過轉錄加工加上去的。mRNA的5’加帽是一個多步加工過程，第一步是鳥苷轉移酶（guanylyltransferase）將一個鳥苷酸加在5’RNA的前端，產生5’-5’對接的磷酸二酯鍵。第二步由鳥嘌呤甲基轉移酶（quaninemethyltransferase）將一個甲基基團加到嘌呤環(huán)的7位氮原子使5‘帽子鳥嘌呤轉變?yōu)?-甲基鳥嘌呤。1.2.2真核mRNA的加工31精選課件ppt存在于各類帽子中存在于Ⅰ類帽子中存在于Ⅱ類帽子中真核生物的帽子結構有三類Type0cap:m7GpppXTypeⅠcap:m7GpppXmTypeⅡcap:m7GpppXmYm帽結構的形成與甲基化位點CH3CH332精選課件pptmRNA5'加帽的功能主要表現(xiàn)在4個方面：1）保護mRNA5’端不被降解

細胞內存在許多RNA酶（RNase），它們可攻擊游離的RNA分子。RNA酶的降解從5‘端起始，當在mRNA的5’端加上m7GpppG帽子后，帶有3個連接磷酸的5‘帽可阻止RNase切割。2）為核糖體識別mRNA提供信號，提高翻譯效率

真核生物mRNA必須通過5'帽結合蛋白才能接觸核糖體，起始翻譯。缺少加帽的mRNA由于不能被5'帽結合蛋白識別，其翻譯效率比加帽的mRNA低二十倍。33精選課件ppt

3）作為進出細胞核的識別標記。凡由PolII轉錄的RNA均在5‘端加帽，包括snRNA，這是RNA分子進出細胞核的識別標記。大多數(shù)snRNA轉錄后在細胞核中接收5’端單甲基m7G加帽，然后轉移到細胞質與snRNP蛋白結合。在細胞質中snRNA5‘帽需再修飾成為三甲基帶帽結構m2，2，7G，隨后重新返回細胞核參與mRNA的剪接加工。U6snRNA由PolIII轉錄，在其5’端保留的三磷酸基團無帽子結構，因而不能輸出細胞核。某些突變型中被輸送到細胞質中的snRNA由于不能合成三甲基帶帽結構，不能返回細胞核。4）提高mRNA的剪接效率。5‘帽結合蛋白涉及第一個內含子剪接復合物的形成，直接影響mRNA的剪接效率。

34精選課件ppt1.2.2.2

mRNA的加尾（3’端多聚腺苷酸化）幾乎所有真核生物成熟的mRNA末端都有一串約250個腺嘌呤核苷酸尾巴。它們并非模板DNA編碼，而是在轉錄完成后由poly(A)多聚酶合成。加尾位置不在轉錄物的最末端，而是在接近末端的內部位點。在切除mRNA3'末端的一段序列后，再加上多聚腺苷酸。真核生物mRNApoly(A)長度并非固定不變。細胞核中的poly(A)長度平均為210±20nt，細胞質poly(A)長度190±20nt。輸送到細胞質中的mRNA其poly(A)可由RNase切短，但又能經(jīng)細胞質poly（A）酶重新加長，保持有限的長度。細胞質中mRNA的poly(A)長度總的趨勢是逐漸變短，直到丟失大部分或全部poly（A），此時mRNA的壽命亦接近終點。1.2.2真核mRNA的加工35精選課件ppt加尾信號新合成的mRNA的3‘-端含兩個明顯的加尾信號。第一個加尾信號位于poly(A)上游約10

20個核苷酸處。其一致順序為5‘

AAUAAA

3’。該加尾信號中最多的變異發(fā)生在第二個堿基，其它位置的堿基代換將使Poly(A)加尾效率急劇下降。第二個加尾信號位于5'

AAUAAA

3'順序下游約15-24bp位置處，有一段富GU序列，緊隨其后通常有一串富T的順序：

5'-AAUAAA-----24bp----GTGTGTTGGAATTTTTTGTGT--3'

36精選課件pptCPSF:cleavageandpolyadenylationspecifityfactorCstF:cleavagestimulationfactor37精選課件ppt38精選課件ppt如果改變5‘

AAUAAA

3’位置，加尾位點改變。缺失5‘

AAUAAA

3’順序，則不發(fā)生加尾。富GU序列和緊隨其后的富T序列對正常的加尾不可缺一，如保留富GU順序，除去富T順序，加尾效率僅及對照的30%。如保留富T順序，除去富GU順序，加尾效率降至10%。同時缺失GU序列和富T序列，即使保留5'

AAUAAA

3'順序也不能進行加尾。此外，GU/T序列與5'

AAUAAA

3'順序的相對位置也很重要，如在5'

AAUAAA

3'順序的下游插入16bp，加尾效率只有正常的10%。如在GU序列和富T序列之間插入5bp，加尾效率喪失70%。39精選課件ppt40精選課件pptmRNA的多聚腺苷酸化mRNA的多聚腺苷酸化涉及兩個步驟，首先必須在加尾的核苷酸位置切斷RNA，然后在游離的3‘末端進行多聚腺苷酸化。有許多蛋白質參與poly(A)的加尾事件。

1）參與Poly(A)加尾的蛋白質稱為切割與多聚腺苷酸化專性因子（cleavageandpolyadenylationspecificityfactor,CPSF），CPSF專一性與加尾信號5’

AAUAAA

3‘結合。

2）另一個蛋白即切割激發(fā)因子CstF（cleavagestimulationfactor,CstF）特異附著在富GU區(qū)。因此CPSF和CstF實際結合的位置處于切割與多聚腺苷酸化位點兩側。CPSF或CstF單個因子與信號順序結合都是不穩(wěn)定的，只有兩者同時附著在兩個信號位置才保持穩(wěn)定狀態(tài)。

3）此外還有另兩個蛋白對RNA的切割必不可少，它們分別是切割因子I和II（cleavagefactorsIandII，CFI和CFII），可與RNA結合。poly（A）多聚酶，CFI和CFII與RNA結合的位置處于兩個加尾信號之間。雖然切割與加尾是兩個性質不同的事件，但實際進行時幾乎同時發(fā)生，實驗設計很難將其分開。41精選課件ppt42精選課件ppt嚴格說來切割信號和加尾信號是不相同的。前體mRNA切割的位置處于5‘

AAUAAA

3’下游15-25nt之間，由切割酶專一性識別。poly（A）多聚酶只是利用已產生的3‘游離末端將腺苷酸逐個連接，加尾信號實際上是5’

AAUAAA

3‘以及下游一段不能少于8nt的順序。一旦mRNA前體被切斷之后，多聚腺苷酸化立即開始。多聚腺苷酸化可細分為兩個階段，首先依賴5'

AAUAAA

3'信號和與之結合的CPSF緩慢合成約10個核苷酸，然后依賴已合成的寡聚腺苷酸迅速在其末端加上200或更多個腺苷酸。43精選課件pptCleavageofthe3￠endofhistonemRNAmayrequireasmallRNA·HistonemRNAsarenotpolyadenylated;their3￠endsaregeneratedbyacleavagereactionthatdependsonthestructureofthemRNA.·ThecleavagereactionrequirestheSLBPtobindtoastem-loopstructure,andtheU7snRNAtopairwithanadjacentsingle-strandedregion.44精選課件ppt45精選課件pptpoly（A）的功能增加mRNA的穩(wěn)定性

將攜帶或缺少poly（A）的球蛋白mRNA注入到蛙卵中，結果發(fā)現(xiàn)，在6小時后缺少poly（A）的球蛋白mRNA不再進行翻譯，而攜帶poly（A）的處理仍然正常合成球蛋白。最簡單的解釋是，poly（A）有助于增加mRNA的穩(wěn)定性提高mRNA翻譯效率

mRNA的翻譯需要PABI（poly（A）bindingproteinI，poly（A）結合蛋白I）的蛋白參與，它們與poly（A）的結合可提高mRNA的翻譯效率。如果在mRNA樣品中加入過量的poly（A），可急劇降低蛋白質合成的數(shù)量。原因在于大量poly（A）與PABI因子竟爭性結合，使mRNA缺少必需的PABI，因而不能有效翻譯。此外適當延長poly（A）核苷酸數(shù)目可控制mRNA的翻譯。活細胞中很少mRNA的poly（A）長度少于30nt，低于這一長度mRNA不能翻譯。poly（A）可影響mRNA前體最后一個內含子的剪切，缺少poly（A）使剪接效率降低5-10倍。46精選課件ppt播放動畫:

1、mRNASplicing2、LifeCycleofanmRNA47精選課件ppt本次內容1、轉錄后加工2、RNA剪切3、真核生物與原核生物mRNA比較48精選課件ppt1、核酶2、RNA中的內含子3、RNA的剪切4、RNA的編輯和修飾RNA的剪接49精選課件ppt

轉錄后加工是產生各種成熟RNA分子的重要過程在真核生物的mRNA前體中，將內含子（intron）去除，而把外顯子（exon）連接起來形成成熟RNA分子的過程，稱為RNA剪接（RNAsplicing）。50精選課件ppt51精選課件ppt加工過程推測的生理功能加帽反應mRNA從核內向胞質運輸加尾反應轉錄終止，翻譯起始和mRNA降解RNA剪接從mRNA、tRNA和rRNA分子中切除內含子RNA切割從前體RNA中釋放成熟tRNA和rRNARNA加工過程及其生理功能52精選課件ppt1.核酶(ribozyme)核酶(ribozyme)有的譯為核糖擬酶，核酶等。核酶是T．Cech和S．Altman(1981年)在研究四膜蟲rRNA時發(fā)現(xiàn)的，1982年T．Cech由核糖核酸(ribonucleicacid)和酶(enzyme)這兩個詞“重組”成一個新的詞：“ribozyme”。它是指本質為RNA或以RNA為主含有蛋白質輔基的、具有催化功能的一類物質。53精選課件ppt一、核酶核酶和酶的區(qū)別，主要在：一般的酶是純的蛋白質，而核酶是RNA或帶有蛋白的RNA；核酶既是催化劑又是底物，隨著反應的進行，本身也消失了。而酶卻不同，僅催化反應，反應前后其本身的質和量都不發(fā)生改變。54精選課件ppt55精選課件ppt核酶催化的反應分為兩類：自體催化包括：①第一組內含子的自我剪接；②第二組內含子的自我剪切；③植物類病毒和擬病毒的自我剪切。半自體催化包括：①核mRNA內含子的剪切；②錐蟲SLRNA的反式拼接；③tRNA5‘加工

（不屬于轉酯反應內含子的剪接，但也是核酶的活性之一）

除核酶之外，核酸酶和由內含子本身編碼的成熟酶也參與某些內含子的剪切，如真核tRNA內含子和酵母cob基因的內含子的2的剪接。56精選課件ppt2.RNA中的內含子基因長度/kb內含子數(shù)量內含子所占比例/%胰島素1.4267球蛋白1.4269血清蛋白181389膠原蛋白組分Ⅶ3111771Ⅷ因子1862595萎縮性肌強直因子240078＞99部分人類基因中，內含子序列所占比重的分析57精選課件ppt內含子去除、RNA的剪接基本方式：在高等真核生物，核RNA內含子的去除由剪接裝置(splicingapparatus)完成，在外顯子和內含子交界處和內含子內部有可供識別的特異序列，剪接裝置由多種蛋白質和核蛋白組成；有兩類內含子的去除屬自剪接，具有中部核心結構，形成特定的二級結構，RNA具有催化剪接的作用；酵母tRNA的剪接需要蛋白質酶的參與，該酶與tRNA后加工過程中的酶有相似之處。除tRNA的剪接之外，其他RNA的剪接盡管參與反應的要素不同，但都屬于轉酯反應。58精選課件ppt2.1內含子的邊界順序及類型內含子的邊界順序由保守的基序組成比較大量的真核生物mRNA內含子發(fā)現(xiàn)，它們的兩側邊界均有一對保守順序，即5'-端為GU，3'-端為AG，這類稱為GU

AG的內含子均以相同方式剪切。59精選課件ppt60精選課件ppt在不同的真核生物中，內含子的一致順序有不少變化，動物中典型的剪接位置一致順序組成為：

5'

AG

GUAAGU--------------YNYURAY--Y10-20--YAG

3'

其中Y為U或C，N為任何核苷酸，箭頭所指為外顯子與內含子的交界。5’端剪接位稱供體位（donorsite），3’端剪接位稱受體位（acceptorsite）。僅僅GU

AG邊界順序并不能保證內含子的正確剪切，因為在內含子中有不少相同的GU

AG順序。內含子中還有另一段識別剪接邊界必不可少的序列稱為分枝點，位于3‘-端剪接位的上游，具有特征性組成：-YNCURAY-，Y表示嘧啶（U或C），R表示嘌呤（A或G），A是剪接時參與形成分枝的特別位點。緊接在分枝點的下游有一段多嘧啶序列，也是參與剪接事件蛋白接合的位置。酵母中分枝點序列為5’

UACUAAC

3‘，位于3’剪接位上游18到140bp之間，其作用不同于高等真核生物。61精選課件ppt類型分布GU-AG內含子真核生物細胞核前體mRNAAU-AC內含子真核生物細胞核前體mRNAI型（GroupⅠ）內含子真核生物細胞核前體rRNA細胞器RNA,少數(shù)細菌RNAII型（GroupⅡ）內含子細胞器RNA，某些原核RNAIII型（Group

Ⅲ）內含子細胞器RNA雙內含子（Twintron）細胞器RNA前體tRNA內含子真核生物細胞核前體tRNA古細菌內含子不同的RNA2.2內含子的類型62精選課件ppt63精選課件ppt3、RNA的剪切3.1mRNA前體的剪切3.1.1核內小RNA3.1.2RNA的剪切過程3.2Ⅰ類內含子剪切3.3Ⅱ類內含子剪切3.4順式剪切與反式剪切64精選課件ppt3.1.1核內小RNA3.1.2RNA的剪切過程3.1mRNA前體的剪切65精選課件ppt3.1.1剪接要求snRNAs的參與在高等生物中都含有很多不連接的小分子RNA片段，限制在核內的稱為小分子核內RNA(smallnuclearRNAs，snRNAs)。在細胞質的稱為小分子胞質內RNA（smallcytoplasmic

RNAs，scRNA)在自然狀態(tài)下，它們以核糖核蛋白（RNP）的形式存在。剪接裝置中的snRNPs和大量的附加蛋白，常稱為剪接因子。66精選課件ppt在剪接過程中有5種snRNAs(smallnuclearRNAs)參加，它們是U1、U2、U5、U4、和U6。5種snRNAs+proteins→ThesnRNPs→splicesome67精選課件pptU1snRNA

堿基互補配對方式識別mRNA前體5‘剪切點U2輔助因子

與3’剪切點上游的富嘧啶區(qū)結合識別mRNA前體3‘剪切點U2snRNP

與分支點結合U2snRNA

剪切前體

60S剪切體spliceosome

U4、U5、U6

snRNP三聚體68精選課件pptU1snRNA自我配對形成了多個莖環(huán)結構，從而構成了不同的功能區(qū)。Sm結合位點是和其他snRNP相互作用的區(qū)域。其5’端有一保守序列：

3’-CAUUCAU-5’這一序列可與核mRNA內含子5’端的邊界序列互補結合，這對于剪接反應是很重要的。69精選課件pptU2與分枝點配對；U6與mRNA5’端配對U5使兩個外顯子靠攏70精選課件pptU6snRNA既能與U4配對也能與U2配對71精選課件ppt3.1.2核mRNA的剪接核mRNA的剪接過程和Ⅱ類內含子十分相似，根本區(qū)別是：核mRNA前體本身不能形成二級結構，必需依賴于snRNP(U1,U2,U4,U5和U6)的幫助才能形成剪接體，進行自我剪接。結構特點：邊界順序完全符合GU-AG法則含分枝點序列

內含子5’端保守序列（5’GUAAGUA3’）

和U1snRNA的5’端保守序列3’CAUUCAU5’互補

72精選課件ppt剪接機制73精選課件ppt在剪接體的作用下通過轉酯反應而完成形成一個套索（lariat）結構和剪接了的外顯子snRNP的剪接功能和反應步驟是：U1結合→形成Ecomplex（下頁圖）→Acomplex(U2結合)→B1complex

→B2complex→C1complex→C2complex74精選課件pptThefirstcomplexformedduringsplicingistheE(earlypresplicing)complex,whichcontainsU1snRNP,thesplicingfactorU2AF,andmembersofafamilycalledSRproteins,whichcompriseanimportantgroupofsplicingfactorsandregulators.75精選課件pptu1u2u5u4u6u1u4u5u4u6u2u5u5u2u6u1u1u2u2u2u6Ecomplex+U2Acomplex(U2與分枝位結合)B1complex(U5/U4/U6三聚體結合，U5結合在外顯子5’端，U6與U2結合)B2complex(釋放出U1,U5從外顯子向內含子移動，U6結合在5’剪接位點)C1complex(釋放出U4,U6/U4催化轉酯反應，U5結合在外顯子3’剪接位點.5’位點被切開，形成套索)C2complex(U2/U5/U6仍結合在套索上。3’位點被切開，外顯子被連接)釋放出剪接了的RNA,套索脫分枝成線狀?！?6精選課件ppt77精選課件ppt78精選課件ppt播放動畫mRNAsplicing.mov

79精選課件ppt3.2Ⅰ類內含子及其剪接1.發(fā)現(xiàn)

Cechetal.1981研究四膜蟲（Tetrahymenathermophila）35S的前體rRNA（含有413nt的內含子）↓

在體外能夠進行自我剪接80精選課件ppt2.分布

Ⅰ類內含子常分布于低等真核生物的細胞器中，如四膜蟲的rRNA；大部分真菌如酵母的mtDNA；植物葉綠體基因的內含子；T4噬菌體的3個基因中也存在Ⅰ類內含子3.結構特點

邊界序列為5’U——G3’

內含子中有中部核心結構(centralcorestucture)

內部引導序列（internalguidesequenece,IGS）81精選課件pptⅠ類內含子有一個共同的二級結構，共9個配對區(qū)（P1—P9），其中P4和P7是Ⅰ類內含子中共有的保守序列。P4由P和Q序列形成，長10nt，配對堿基6－7對。P7由R和S序列構成，長12nt，5對堿基配對。P3,P4,P6和P7是核心結構，是可以執(zhí)行催化的最小區(qū)域。其他的配對區(qū)在不同的內含子中是不同的。IGS82精選課件ppt內部引導序列（internalguidesequenece,IGS）：1982年由Davies提出，由6個nt組成，GGAGGG（四膜蟲）。內含子中可與外顯子配對的序列稱為內部引導區(qū)。最初認為IGS的作用是通過和兩個外顯子近側區(qū)配對，使外顯子并在一起，現(xiàn)在認為其作用是決定剪接的專一性。

83精選課件pptⅠ類內含子的剪接機制

自剪接（self-splicing）反應，通過3次連續(xù)的轉酯反應完成。只是磷酸酯鍵的直接轉移，沒有水解，不需能量。84精選課件ppt特點：由于內含子自身形成特定的二級三級結構，從而產生適于剪接反應的空間構象和活性位點，相當于傳統(tǒng)酶的激活位點，即G苷酸結合位點和底物結合位點，后者依賴于IGS的配對來確定。G的參與完成剪接反應。即剪接反應完全由內含子自身完成。85精選課件ppt86精選課件ppt87精選課件ppt88精選課件ppt89精選課件ppt90精選課件ppt3.3Ⅱ類內含子的剪接Ⅱ類內含子的剪接和Ⅰ類內含子不同，而和核mRNA內含子的剪切有些相似。分布：在酵母mtRNA,細胞色素氧化酶的a亞基、b亞基，玉米mtRNA、tRNA以及真核mRNA前體中。邊界序列為5’↓GUGCG---YnAG↓,符合GT—AG法則91精選課件ppt

Ⅱ類內含子的二級結構二級結構：形成6個莖環(huán)結構，使兩個并列的功能區(qū)靠近。功能區(qū)5和功能區(qū)6被兩個堿基隔開。功能區(qū)6含有1個不配對A殘基，其上帶有2－OH,發(fā)動第一次轉酯反應。

92精選課件ppt與前所敘的核基因mRNA的剪接過程相比，Ⅱ類內含子的最大特定是不需要其他成分的參與，RNA分子本身能形成剪接所需的空間結構和催化活性區(qū)域。在核基因mRNA的剪接過程中，需要多種成分特別是snRNA與RNA前體共同作用才能形成剪接所需的空間結構，產生具催化功能的區(qū)域。93精選課件pptⅡ類內含子的剪接機制94精選課件pptDNA(promoter)→RNA(splicing)→Proteins95精選課件ppt3.4順式剪切與反式剪接

3.4.1順式剪接（cis-splicing）內含子的剪接一般都是發(fā)生在同一個基因內，切除內含子，相鄰的外顯子彼此連接，稱為順式剪接。對很多基因而言，RNA剪接是一個不變的加工過程?；蜣D錄時所有細胞中產生同樣的成熟轉錄本及單種產物。這稱為組成型剪接(constructivesplicing)。

其他一些基因，RNA剪接可以作為基因調節(jié)的機制，也就是說在兩種組織中同一基因表達不同，盡管它以相同的方式和速度轉錄。這樣的調節(jié)以兩種方式發(fā)生。96精選課件ppt

第一種情況:

加工或去除調節(jié)(processingordiscardregulation)，初始轉錄本在一些組織中加工，在其他組織中不剪接。在有些低等真核生物中(如海膽)，這是主要調節(jié)機制。大部分基因在大部分組織中轉錄，由RNA加工調節(jié)來決定那些基因被翻譯。在果蠅中，一個類似的機制用來控制P因子轉座酶(參閱)的合成，在這種情況下雖然只有一個內含子未被剪接，但卻限制了P因子轉座只發(fā)生在生殖細胞中。轉座酶基因包含三個內含子，在生殖細胞中產生成熟的編碼轉座酶的轉錄本，然而在其他組織中，第三個含終止密碼子的內含子被保留，使轉座酶蛋白截短，從而阻止體細胞中P因子的轉座。內源性基因也用同樣的策略，如哺乳動物GABAA受體E亞基的mRNA前體除了腦以外其他組織都不剪接。

97精選課件ppt第二種情況:

差別或選擇性剪接(differentialalternativesplicing)基本轉錄體通過選擇使用外顯子以不同方式加工相關成熟轉錄體家族產生不同基因產物，稱為剪接變異體(splicevariants)或剪接異構體(spliceisoforms)。98精選課件ppt可變剪接產生多種RNA99精選課件ppt100精選課件ppt選擇性剪接以多種方式進行：

1）利用不同的外顯子由于不同細胞類型有著不同修飾的反式因子，導致利用不同的外顯子。例如動物細胞的原肌球蛋白(atropomyosin)

基因有13個外顯子。101精選課件ppt2)兩個相互排斥的外顯子的剪接

有兩類外顯子對，每對之中只有一個成員能剪接到成熟的mRNA中，看來像是相互排斥似的。降鈣素(calcitonin)和降鈣素基因相關肽(calcitoningenerelatedpeptide，CGRP)分別利用相鄰的兩個外顯子，得到的兩種產物分別為甲狀腺和神經(jīng)元細胞中所特有。

102精選課件ppt(3)半個起始位點，多個加poly(A)位點

一些真核病毒轉錄物存在多至5個這樣的位點(Tsurshital988)。對于一個有兩個加poly(A)位點的轉錄物，大多數(shù)細胞類型通過利用內側的位點產生分泌型的蛋白，一些分化的細胞類型犀其產物是膜蛋白的轉錄物，則利用外側的位點產生具有膜錨序列的膜結合蛋白。還是用降鈣素和CGRP的例子，前者利用內側的加poly(A)位點，后者則利用外側的?？赡艽嬖谀撤N細胞類型特異的反式激活因子提高外側位點的利用效率。103精選課件ppt(4)多個5’剪接位點競爭同一3’剪接位點有一些基因含有多個5’剪接位點，它們的選擇依賴于5’剪接位點的強度(高度適配者強)、與3’剪接位點的接近程度、空間限制等因素之間的平衡。在大多數(shù)細胞類型中將選擇上游的5’剪接位點，而使處于下游的5’剪接位點無效，主要是因為后者與分叉點的距離一般太近而不利于建立剪接體之故(Noblel988)。也有的分別利用不同的5’剪接位點，得到不同的產物。104精選課件ppt(5)內含子保留和框式外顯子

有的情況下，一個內含子不被剪接而保留下來，如果維持可讀框架，便是一個多肽片段的插入；如果移格，便會產生功能不同的產物或者關掉基因的表達。所謂盒式外顯子是指那些與其他鄰近的外顯子的剪接無關而獨立剪接的外顯子。當幾個盒式外顯子存在于同一個轉錄物中，其產物會產生高度的趨異，如一個基因含有5個盒式外顯子，再加上一對相互排斥的外顯子，在理論上可以生64種同工型多肽。真核基因存在5個以上的外顯子是常有的，甚至多達37個外顯子，由此產生蛋白質的多樣性是十分豐富的。105精選課件ppt肌鈣蛋白T有13個外顯子，編碼259個氨基酸殘基，然而此蛋白的長度在體內不同部位的肌肉中是不同的。有11個外顯子(黑框)是所有mRNA都有的；外顯子4—8(白框)則可自由組合(4、6、8，4、7、8，7、8等等)，共有32種可能性；外顯子16和17(灰框)是相互排斥的，兩者只能有一個出現(xiàn)在成熟的蛋白質中。這樣，總共就有64種可能的mRNA。106精選課件ppt(6)非剪接位點的序列參與調節(jié)

一些真核生物的病毒RNA其初級轉錄物即使有正確的功能剪接位點，有時也會有一部分甚至大部分不發(fā)生剪接(ArrigoandBeemon1988)。這是由于其內含子中存在一種負調節(jié)元件使剪接無效，也有的基因在外顯子中存在一些促進和抑制剪接的序列。107精選課件ppt返回返回返回108精選課件ppt順式剪接機理：109精選課件ppt

U群snRNA+多肽→snRNPU群snRNA是一群豐富的小分子RNA,其序列進化上相對保守，但通過轉錄后堿基修飾會導致其二級結構的改變，因而構成不同功能的snRNP,使之識別和競爭不同的剪接位點。剪接體/拼接體的裝配：1、U1snRNP與5’剪接位點結合2、U2snRNP與分枝點結合3、U4/U6和U5snRNP結合上4、最后形成剪接體，U5既與5’剪接位點也與3’剪接位點結合。110精選課件ppt

參加剪接反應的蛋白質因子有兩種類型：

一類結合在UsnRNA上形成snRNP復合物，例如Sm蛋白，共同地與U1、U2、U5snRNA緊密結合；U1snRNP中有3種而U5snRNP有7種蛋白緊密地與之特異結合。另外，還有一些蛋白暫時地與snRNP組分相互作用并起著特殊的作用，它們是一些RNA依賴的ATPase和螺旋酶，如酵母的PRP24促進U4—U6復合物的形成，PRP4通過蛋白—蛋白相互作用結合U4—U6snRNP和U5snRNP形成上述的三元snRNP復合物；PRP8與U5snRNP結合并和3’剪接位點相互作用。這些蛋白的一部分基序結合到RNA上，另一部分結合到蛋白質上形成蛋白“橋”，介導RNA-RNA相互作用，以及剪接體構象改變，通過決定構象改變的計時來影響剪接。

111精選課件ppt另一類是一些結構相關進化上保守的蛋白質因子，稱之為SR(SRP)家族。已發(fā)現(xiàn)此家族的成員有SRP20、SRP30a、(SF2／ASF)、SRP30b(PR264／SC35)、SRP40、SRP55、SRP70～75(數(shù)字表示分子質量，kDa)，這些蛋白的N端有一個共同的基序(RRM或RBD)識別和結合RNA；其C端長度變化，由交替的絲氨酸和精氨酸殘基組成的結構域可能和結合特異性有關。這些蛋白在剪接過程早期起著幫助前mRNA投入剪接，后期護送snRNP加入剪接體，在剪接的兩步反應中一直與剪接體締合。由于這些蛋白因子的表達量是組織特異的，而它們存在的量和剪接位點的選擇又相關，因而不同的SRP蛋白對不同的剪接位點的優(yōu)先利用表現(xiàn)為一種組織特異性。SRP蛋白在離體剪接中都表現(xiàn)出活性的互補，但不同的SRP蛋白有其保守性，又說明每種SRP蛋白應有其不同的功能。112精選課件ppt

3.4.2反式剪接(trans—splicing)

前面討論的剪接過程都是發(fā)生在一個RNA分子內部，即通過剪接將一個RNA分子內的內含子剪掉，使外顯子連接在一起——順式剪接(cis-splicing)。但也有另外一種情況，即不同基因的外顯子剪接后相互連接，此稱為反式剪接（trans-splicing）已發(fā)現(xiàn)，在錐蟲、線蟲以及植物的葉綠體中發(fā)生兩個RNA分子之間的剪接，即反式剪接。

113精選課件ppt114精選課件ppt

反式剪接是以兩種不同來源的RNA前體分子作為底物。反式剪接的5’端外顯子稱為剪接前導RNA(splicedleaderRNA，SLRNA)。經(jīng)過剪接在成熟的mRNA非翻譯部分5’端剪接上一小段稱為“剪接前導序列(splicedleader，SL)”或“小外顯子(mini-exon)”的RNA片段。

這些片段本來并不存在于相應的編碼基因前面，而是由其他DNA鏈轉錄而來。已發(fā)現(xiàn)的各種SLRNA有一些共同的特點：都折疊成一種相同的二級結構，此結構有3個莖—環(huán)(stem-loop)和一個單鏈區(qū)，此單鏈區(qū)類似于U1的Sm結合位點。因此，SLRNAs存在和snRNPs相似的形式。115精選課件ppt116精選課件ppt117精選課件ppt118精選課件ppt4RNA的編輯和修飾4.1RNA編輯（RNAediting）某些RNA，特別是mRNA的一種加工方式，它導致了DNA所編碼的遺傳信息的改變，因為經(jīng)過編輯的mRNA序列發(fā)生了不同于模板DNA的變化。

單堿基突變尿苷酸的缺失和添加

119精選課件ppt載脂蛋白B基因有29個外顯子第2153位密碼子CAA編碼谷氨酰胺CAAUAA肝中剪切的mRNA編碼4563個氨基酸殘基的蛋白質腸mRNA因UAA密碼子在2153位密碼子終止合成120精選課件ppt4.2RNA修飾某些RNA，特別是前體rRNA和tRNA還可能有異性化學修飾。121精選課件ppt本次內容