DNA的測序方法、原理及其應(yīng)用課件

DNA的測序方法、原理及其應(yīng)用1精選課件ppt一、DNA序列測定概述及其發(fā)展

即核酸DNA分子一級結(jié)構(gòu)的測定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項(xiàng)重要的技術(shù)。

其基本原理是DNA

的復(fù)制反應(yīng)體系中需要存在DNA

聚合酶、DNA

模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成雙鏈后，DNA

聚合酶在引物的引導(dǎo)下在模板鏈上沿3’→5’的方向移動，dNTP

按照堿基配對原則，逐個連接在引物的3’-OH

末端。

2精選課件ppt1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰島素51個氨基酸的序列測定，這在當(dāng)時(shí)來說是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列測定的方法，Sanger雙脫氧末端終止法和MaxamGilbert化學(xué)裂解法將核酸序列測定技術(shù)推進(jìn)到“直讀”階段，使核酸序列測定變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。3精選課件ppt二、測序的常用方法DNA序列測定常用方法有如下3種：

1、末端終止法2、化學(xué)裂解法3、DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動讀出。優(yōu)點(diǎn)簡便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對寡核苷酸測序。1、高負(fù)荷，1塊膠可測16個樣品；2、機(jī)讀不需放射自顯影；3、安全不用同位素；4、簡單迅速8-10h。4精選課件ppt1）雙脫氧鏈終止法測序(thechainterminationmethod)

基本原理：通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序。5精選課件ppt用于終止反應(yīng)的雙脫氧核苷酸：將2’，3’–雙脫氧核苷酸（ddNTP）參入到新合成的DNA鏈中，由于參入的ddNTP缺乏3’–羥基，因此不能與下一位核苷酸反應(yīng)形成磷酸二酯鍵，DNA合成反應(yīng)將中止。6精選課件pptO堿基CPOH12345O堿基CPHH12345H2O脫氧核苷酸的連接7精選課件pptO堿基CPHH12345O堿基CPOHH12345OHX雙脫氧核苷酸…?8精選課件ppt9精選課件ppt2）Maxam-Gilbert化學(xué)降解法測序基本原理：

①用放射性核素標(biāo)記待測DNA一側(cè)末端

②將標(biāo)記DNA分為G、A+G、C+T、C4個反應(yīng)體系

③用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機(jī)斷裂DNA片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線標(biāo)記的末端，另一端為不同大小的DNA片段的混合物

④電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出DNA序列10精選課件ppt11精選課件ppt表特異斷裂4種脫氧核苷酸的方法作用的堿基試劑與反應(yīng)堿基釋放DNA斷裂強(qiáng)G/弱A稀釋250倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（PH8.0）10MMgCl2、0.1MEDTA20℃60分鐘，DNAG的N7和A的N3甲基化甲基化嘌呤不穩(wěn)定，在中型PH加熱被破壞在0.1M堿中，90℃15分鐘，戊糖脫落，DNA鏈斷裂，G斷裂比A快5倍A同上0.2NHCl、0℃、60分鐘，堿基被破壞同上，A斷裂比G快C+T15-18M聯(lián)苯胺、20℃50分鐘，嘧啶環(huán)被破壞釋放0.5M哌啶處理，斷裂DNA鍵，C與T有同樣速率C2MNaCl，聯(lián)氨處理方法同上，100分鐘，此時(shí)，T的破壞被抑制，只有C被破壞釋放同上，只在C處斷裂DNA鏈12精選課件ppt在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地?cái)嗔袲NA的機(jī)制是：G反應(yīng)硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后斷開了C8-C9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。G+A反應(yīng)（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。T+C反應(yīng)肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。C反應(yīng)在NaCl存在時(shí)，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。13精選課件ppt★堿基特異性修飾及裂解反應(yīng)體系堿基修飾試劑堿基修飾反應(yīng)主鏈斷裂試劑斷裂點(diǎn)G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G和AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C和TC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶C14精選課件ppt15精選課件ppt3）DNA自動化測序特點(diǎn)原理同末端終止法標(biāo)記物為熒光染料激光掃描自動測序結(jié)果清晰、準(zhǔn)確、分辨率高測序速度快200bp/h16精選課件ppt17精選課件ppt18精選課件ppt19精選課件ppt20精選課件ppt21精選課件ppt三、3種方法的比較化學(xué)法沒有末端終止法應(yīng)用廣泛，但有一個明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學(xué)法可以對合成的寡核苷酸進(jìn)行測序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，不能通過化學(xué)保護(hù)及修飾干擾實(shí)驗(yàn)來研究DNA二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。22精選課件pptMaxam-Gilbert法只需簡單化學(xué)試劑。所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學(xué)法可以對合成的寡核苷酸進(jìn)行測序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況。但所能測定的長度要比Sanger法短一些，它對放射性標(biāo)記末端250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。Sanger法雖需要單鏈模板和特異寡核苷酸，并需獲得大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段的高質(zhì)量酶制劑，而隨著M13噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引物容易獲得及測序反應(yīng)日期完善，雙脫氧鏈終止法如今遠(yuǎn)比Maxam-Gilbert法應(yīng)用得廣泛。由于Sanger法既簡便又快速，目前大多數(shù)測序策略都是為Sanger法而設(shè)計(jì)的。23精選課件ppt

DNA自動測序與手工測序的不同點(diǎn)1）標(biāo)記物不同：手工測序采用放射性核素標(biāo)記，而自動測序采用4種熒光染料分別標(biāo)記ddNTP或標(biāo)記引物2)加樣方式不同：手工測序，一個樣品的4個測序反應(yīng)物分別在不同泳道進(jìn)行，而自動測序可在一個泳道內(nèi)電泳3)檢測手段不同：手工測序采用放射自顯影，從4種寡聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出DNA序列，而自動測序則采用激光掃描器同步掃描，計(jì)算機(jī)進(jìn)行閱讀和編輯24精選課件ppt四、DNA序列測定的應(yīng)用1)測序

◆

PCR克隆測序驗(yàn)證◆突變體檢測

◆新基因測序

◆全基因組測序

◆

系統(tǒng)發(fā)育及物種鑒定2)片段分離

◆個體識別：親緣鑒定

◆SNP關(guān)聯(lián)分析

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疾病診斷等25精選課件ppt26一、在線分析的核心網(wǎng)站http://http://bip.weizmann.ac.il/tools/#primaryhttp:///http:///二、本地分析的重要軟件VectorNTISuite6.0及以上的版本：綜合分析、載體分析。DNAStar：綜合分析PrimerPremier5.0：引物設(shè)計(jì)Oligo7：寡核苷酸分析，引物計(jì)算GCG：蛋白質(zhì)、核酸序列2、核苷酸序列的生物信息分析26精選課件ppt西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程271)Genbank序列檢索27精選課件ppt氨基酸序列同源性分析28精選課件ppt堿基序列同源性29精選課件ppt分子進(jìn)化樹分析親緣性關(guān)系HUN0801JS0809HUN0802JS0822HUN0804JS0819JS0821NN0603BLENNN1165Cu-1wtcef94CU1MBH11B87CEGtGLSYN1161Harbin-1NN11