植物組織培養(yǎng)

第九章植物細(xì)胞、組織及器官的超低溫保管植物種質(zhì)資源是植物育種的根底，種質(zhì)資源的保管方式有原生境保管和非原生境保管，非原生境保管包括移地保管〔種質(zhì)圃或植物園保管〕、種質(zhì)〔種子〕庫保管、離體保管等。其中種質(zhì)資源的離體自20世紀(jì)60年代逐漸得到廣泛運用。種質(zhì)資源的離體保管是對離體培育的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等資料，采用限制生長、延緩或停頓其生長的處置使之保管，在需求時可以重新恢復(fù)其生長，并再生植株的方法。離體保管又分為限制生長保管和超低溫保管。限制生長保管是利用限制離體培育物的生長速度來保管種質(zhì)的方法，是離體保管的常用方法。限制離體培育物生長速度的方法主要有：〔1〕低溫保管法〔2〕高浸透壓保管法〔3〕生長抑制劑保管法〔4〕降低氧分壓保管法〔5〕枯燥保管法而超低溫保管是將要保管的資料經(jīng)過適當(dāng)處置后，保管在液氮中〔-196℃〕，植物細(xì)胞生長停頓，但細(xì)胞活力和形狀發(fā)生潛能得到了保管。1949年P(guān)olge發(fā)現(xiàn)甘油具有保管特性，標(biāo)志著低溫生物學(xué)的構(gòu)成；1980年開場進(jìn)展玻璃化保管，開展超低溫保管研討。動物細(xì)胞、組織、胚胎---植物細(xì)胞、組織、器官一、超低溫種質(zhì)保管的開展歷史：堅持細(xì)胞培育物的遺傳穩(wěn)定性；2.長期保管植物的種質(zhì)資源;長期保管農(nóng)作物的優(yōu)良種類及其育種親本資料的種質(zhì)；建立長期保管的莖尖分生組織種質(zhì)庫及無病毒的原種；5.保管實驗資料，防止再培育中遺傳變異。二、超低溫保管的作用及意義在低于-700C的超低溫條件下，有機體細(xì)胞內(nèi)部的生化反響極其緩慢，甚至終止。因此采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸镔Y料降至超低溫，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳镔Y料恢復(fù)至常溫時，其內(nèi)部的生化反響可恢復(fù)正常。三、超低溫保管的原理及實際根據(jù)所謂冷凍保管，就是將體外培育物或生物活性資料懸浮在加有或不加冷凍維護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度〔普通是低于-700C的超低溫條件〕，并在此溫度下對其長期保管的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培育物或生物活性資料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培育的器官都可以進(jìn)展凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。水在低于零度的條件下會結(jié)冰。假設(shè)將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所構(gòu)成的冰晶會呵斥細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。假設(shè)將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。假設(shè)將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會遭到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時，大量水分會因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，呵斥細(xì)胞死亡。這種因保管溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是假設(shè)在溶液中參與冷凍維護劑，那么可維護細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。由于冷凍維護劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的構(gòu)成，并且經(jīng)過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保管。在復(fù)蘇時，普通以很快的速度升溫，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會重新構(gòu)成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍堅持其正常的構(gòu)造和功能。冷凍維護劑對細(xì)胞的冷凍維護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍維護劑其冷凍維護效果也不一樣。1.主要儀器設(shè)備(1)用于組織和細(xì)胞培育的全套設(shè)備；(2)普通電冰箱；(3)-70℃--80℃的低溫冰箱；(4)程序降溫器；四、超低溫保管的根本設(shè)備和程序(5)玻璃或塑料試管〔5ml或10m1〕，封蓋嚴(yán)密，不進(jìn)液氮；(6)液氮;(7)光學(xué)顯微鏡和紫外熒光顯微鏡；(8)分光光度計。2.根本程序(1)資料的預(yù)備與選擇。(2)預(yù)處置。(3)將資料裝入試管，并隨即插入冰浴中。(4)參與0℃預(yù)冷的冰維護劑，在0℃(冰浴中)放置30一45分鐘。(5)降溫冰凍。(6)保管后的化凍：普通在37—40℃溫水浴中快速化凍。(7)活力測定,通常采用TTC法(氯化三苯四氮唑復(fù)原法)。假設(shè)是單細(xì)胞或原生質(zhì)體，可采用活性熒光素染色法，顯示活細(xì)胞，統(tǒng)計存活率。(8)再培育，察看組織細(xì)胞恢復(fù)生長的速度、存活率、植株的再生才干。(9)遺傳性狀的分析：如植株的形狀特征、生長發(fā)育情況、染色體、同工酶及抗逆性等。1．資料的特性；基因型、抗凍性、器官組織和細(xì)胞年齡、生理形狀。2．預(yù)處置目的：A.添加細(xì)胞分裂和同步化；B.減少細(xì)胞內(nèi)自在水的含量；C.加強細(xì)胞的抗寒性。五、影響超低溫保管效果的主要要素預(yù)處置方法：(1)細(xì)胞、組織繼代培育中．細(xì)胞分裂分化同步化的調(diào)控，添加指數(shù)生長期細(xì)胞。(2)預(yù)培育，添加培育基中的糖濃度，提高浸透壓；或在預(yù)培育基中參與誘導(dǎo)抗寒力的物質(zhì)或冰凍維護劑，如零落酸(ABA)，山梨糖醇、脯氨酸及二甲基亞砜(DMSO)等。(3)低溫鍛煉：如香石竹莖尖經(jīng)4℃低溫預(yù)處置14天，不僅提高了存活率．而且分化率從30％添加到60％。3．冰凍維護劑迄今，曾經(jīng)報道了多種類型的冰凍維護劑。常用的是二甲基亞砜(DMSO)、甘油、糖和糖醇類物質(zhì)、氨基酸、多肽及聚乙二醇等。但作為冰凍維護劑的物質(zhì)應(yīng)該具備以下特性：〔1〕易溶于水；〔2〕在適當(dāng)濃度下對細(xì)胞無毒；〔3〕化凍后容易從組織細(xì)胞中去除。冷凍維護劑的作用：(1)降低冰點，促進(jìn)過冷卻和“玻璃態(tài)化〞的構(gòu)成；(2)提高溶液的粘滯性，阻止冰晶的生長，(3)DMSO可使膜物質(zhì)分子重新分布，添加細(xì)胞膜的透性，在溫度降低時，加速細(xì)胞內(nèi)的水流到細(xì)胞外結(jié)冰，防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的損傷；(4)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的大分子構(gòu)造，特別是膜構(gòu)造，阻止低溫?fù)p傷，非透性維護劑的主要作用在質(zhì)膜上。4．降溫冰凍方法(1)快速冰凍法：將資料從0℃，或者其他預(yù)處置溫度(如木本植物的冬芽在-3℃一-10℃預(yù)處置20天)直接投入液氮。其降溫速度在每分鐘l000℃以上。植物體內(nèi)的水分在降溫冰凍過程中，從-10℃到-140℃是冰晶構(gòu)成和增長的危險溫度區(qū)，在-140℃以下，冰晶不再增生。因此，快速冰凍法勝利的關(guān)鍵在于，利用超速冷凍，使細(xì)胞內(nèi)的水分迅速經(jīng)過冰晶生長的危險溫度區(qū)，即細(xì)胞內(nèi)的水分還未來得及構(gòu)成冰晶中心，就降到了-196℃的平安溫度，從而防止了細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的危險。(2)慢速冰凍法：通常成熟的植物細(xì)胞都具有大的液泡，含有大量水分。對大多數(shù)植物資料說來，不適宜采用快速冰凍法，而需求在冰凍維護劑存在的條件下，采用慢速冰凍法。以每分鐘0.1-10℃的降溫速度(普通1—2℃／分較好)。降到—70℃左右，隨即浸入液氮，或者以此種速度延續(xù)降到一196℃。在這種降溫速度下，可以使細(xì)胞內(nèi)的水分有充足的時間不斷流到細(xì)胞外結(jié)冰，從而使細(xì)胞內(nèi)的水分減少到最低限制，到達(dá)良好的脫水效應(yīng)，防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。(3)兩步冰凍法：這種方法是慢凍法和快凍法的結(jié)合，或者說，是一種改良的慢凍法。第一步是用慢速降溫法從0℃降到一定的預(yù)凍溫度，使細(xì)胞到達(dá)適當(dāng)?shù)木S護性脫水；第二步，投入液氮中迅速冰凍。(4)逐級冰凍法：此方法是制備不同等級溫度的冰浴，如—10℃，—15℃，—23℃，—35℃，或—40℃等。保管資料經(jīng)冰凍維護劑在0℃預(yù)處置后，逐漸經(jīng)過這些溫度，樣品在每級溫度上停留一定時間(4—6分鐘)，然后浸入液氮。5．化凍方法實驗證據(jù)證明，植物的凍害常發(fā)生在冰涼和化凍兩個過程。因此要使植物種質(zhì)的超低溫保管獲得勝利，不僅要求有一個適宜的降溫冰凍程序，而且還要求采取適宜的化凍方法，以防止在化凍過程中產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的次生結(jié)冰，并應(yīng)防止在化凍吸水過程中水的浸透沖擊對細(xì)胞膜體系的破壞。通常采用快速化凍方法，即將液氮保管后的資料在37—40℃的溫水浴中化凍。由于超低溫冰凍資料化凍時，再次結(jié)冰的危險溫度區(qū)域大約是—50℃至—10℃。從實際上說，借助迅速的化凍速度經(jīng)過此溫度區(qū)，從而防止細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰。6．光照對恢復(fù)生長的影響黑暗條件下有利于超低溫保管培育物的恢復(fù)生長。顯示細(xì)跑活力的TTC法(氯化三苯四氮唑復(fù)原法)，反映脫氫酶活力。2．顯示細(xì)胞存活率的二醋酸酯熒光素(FDA)染色法，反映酯酶的脫脂化作用，或采用中性紅染色法。3.再培育新穎培育基上培育。存在停滯期。六、超低溫保管后細(xì)胞活力、存活率及遺傳特性的觀測4.遺傳性狀的分析：1)細(xì)胞全能性的堅持：形狀發(fā)生才干的表達(dá)情況。2)后代的形狀特征及生長發(fā)育情況。3)后代染色體的分析。4)同工酶譜的分析。5)特殊產(chǎn)物的分析。6)抗逆性的分析。1.已進(jìn)展超低溫保管的植物：目前已超越30種植物勝利進(jìn)展了愈傷組織及懸浮細(xì)胞超低溫保管。保管后的資料表現(xiàn)出較高的存活率。七、愈傷組織及懸浮培育細(xì)胞的超低溫保管2．組織和細(xì)胞超低溫保管實驗程序(1)將培育5一7天的懸浮培育細(xì)胞，或培育10一15天的愈傷組織搜集于保管試管中，每管0.5-1.0ml。(2)將盛有資料的試管插入冰浴中，待溫度平衡后，參與0℃預(yù)冷的冰凍維護劑(10％DMSO+0.5mo1／L山梨糖醇)，使維護劑稍淹過保管資料。在0℃放置30分鐘。(3)以1℃／分的降溫速度從0℃降到-10℃，悄然搖動試管，使試管內(nèi)的溶液結(jié)冰。停留15－20分鐘。然后以同樣降溫進(jìn)度降到-30℃－-40℃，停留2小時，然后浸入液氮中。(4)在液氮中儲存一定時期后，取出資料在37—40℃溫水浴迅速化凍，化凍后立刻轉(zhuǎn)移到20℃水浴中。(5)化凍后，用含3％蔗糖的液體培育基洗滌3次，為減輕和防止浸透沖擊的損傷，培育液應(yīng)逐漸參與。(6)洗滌后立刻轉(zhuǎn)移到新穎培育基上進(jìn)展再培育：或者不經(jīng)洗滌，直接轉(zhuǎn)移到半固體培育基上，或漂浮于液體培育基的濾紙上培育。先置于黑暗條件下培育15—30天，然后轉(zhuǎn)移到光照下培育。(7)待恢復(fù)生長后，統(tǒng)計存活率。此外，在化凍洗滌后，可采TTC法和FDA熒光染色法觀測細(xì)胞的活力和存活率。(8)當(dāng)愈傷組織長到良好形狀時，轉(zhuǎn)移到分化培育基上，檢驗形狀發(fā)生才干的堅持情況。(9)植株形狀特征、生長發(fā)育及遺傳性狀的察看和分析．1、莖尖超低溫保管植物種類：八、芽及莖尖分生組織的超低溫保管2.莖尖分生組織的超低溫保管程序：〔1〕種子消毒滅菌，種子經(jīng)70％酒精迅速漂洗，10％漂白粉溶液消毒20分鐘，無菌水洗滌4次．(2)在無菌條件下播種于具潤濕濾紙的滅菌培育瓶或培育皿內(nèi)。置于25—28℃培育箱中黑暗培育。(3)萌生生長4—5天后，在無菌條件下切取莖尖的分生組織，0.3一0.5mm長，第1對葉原基。在實體解副鏡下進(jìn)展操作。(4)將切取的莖尖分生組織接種于固體B5培育基上，內(nèi)含0.5pmol／LBA及5%DMSO，光照16小時，溫度20℃／15℃預(yù)培育48小時。(5)預(yù)培育后，將培育瓶浸入冰浴中2小時。(6)將莖尖分生組織轉(zhuǎn)移到在冰浴中預(yù)冷的具有1m1液體B5培育基的離心管中。(7)逐漸參與等體積的預(yù)冷的10％DMSO，在30分鐘內(nèi)加完，使DMSO的最終濃度為5%，然后再放置10一30分鐘．(8)密封離心管口，以每分鐘降低0.6℃的速度慢速降溫到—40℃，然后浸入液氮中(—196℃)。(9)在液氮中儲存—定時期后，取出資料在27℃水浴中迅速化凍。化凍后．立刻將試管轉(zhuǎn)移到冰浴中．(10)用等體積B5培育基在30分鐘內(nèi)，分6次逐漸參與試管中。(11)吸去混合液，并用B5培育基洗滌4次。然后將莖尖分生組織轉(zhuǎn)移到固體B5分化培育基上。3周后可分化成苗。植株的再生率達(dá)70％以上，已有的實驗闡明，儲存2年多仍能存活。Sakai(1990)和Yamada(1991)建立了一種莖尖分生組織的超低溫保管簡便方法，該技術(shù)的關(guān)鍵是，在冰凍前，用高濃度的冰凍維護劑使保管資料脫水，以致不需求慢速程序降溫，從室溫直接浸入液氯，即可獲得很高的存活率。保管程序：(1)從試管苗中切取莖尖分生組織。(2)在含1．2mo1／L山梨糖醇的B5培育基上4℃預(yù)培育2天。(3)將預(yù)培育后分生組織放入試管，然后參與高濃度的冰凍維護劑。在含0。4mo1／L蔗糖的B5培育基中溶解30％(w／v)甘油，35％(W／v)乙二醇和15