多肽類藥物資料

多肽類藥物多肽和蛋白質(zhì)類生物藥物按藥物的結(jié)構(gòu)分類可分為：氨基酸及其衍生物類藥物、多肽和蛋白質(zhì)類藥物、酶和輔酶類藥物、核酸及其降解物和衍生物類藥物、糖類藥物、脂類藥物、細(xì)胞生長(zhǎng)因子和生物制品類藥物。結(jié)構(gòu)分析多肽的定性至少應(yīng)包括氨基酸分析、序列分析及質(zhì)譜分析。純肽的氨基酸分析可提供該多肽的氨基酸組成和數(shù)量。序列分析則提供氨基酸殘基的精確排列順序。基于多種技術(shù)的質(zhì)譜,如快原子轟擊、電噴霧、激光解吸,經(jīng)常用于提供多肽的相對(duì)分子量及其序列信息。肽譜是蛋白質(zhì)或多肽通過(guò)酶解得到的肽片段經(jīng)分離和分析所得到的“指紋圖譜”。當(dāng)多肽含有20個(gè)以上的氨基酸殘基時(shí),肽譜分析對(duì)多肽結(jié)構(gòu)研究和特性鑒別具有重要意義。2.1氨基酸分析用于氨基酸分析的水解方法主要是酸水解,同時(shí)輔以堿水解。酸水解中使用最廣泛的是鹽酸(一般濃度為6mol?L)。多肽于110℃真空或充氮的安瓿瓶?jī)?nèi)水解10～24h,然后除去鹽酸。水解過(guò)程中氨基酸遭破壞的程度與保溫時(shí)間有線性關(guān)系,因此該氨基酸在多肽中的真實(shí)含量可通過(guò)以不同的保溫時(shí)間對(duì)相應(yīng)時(shí)間的樣品中該氨基酸的含量作圖,用外推法求出。高氨基酸分析儀的使用使氨基酸的分析越來(lái)越準(zhǔn)確,如Waters公司的氨基酸分析系統(tǒng)的檢出限已達(dá)100fmol。2.2序列分析氨基酸測(cè)序主要為化學(xué)法,酶法也有一定的意義。化學(xué)法以Edman降解法最為經(jīng)典,它對(duì)所有氨基酸殘基具有普適性和近乎定量的高產(chǎn)率,是近50年N2端順序分析技術(shù)的基礎(chǔ)。Edman機(jī)理的液相(旋轉(zhuǎn)杯)自動(dòng)蛋白順序分析儀在1967年推出。近年來(lái)不斷對(duì)其改進(jìn),其靈敏度已達(dá)到可以對(duì)0.1pmol的樣品進(jìn)行常規(guī)分析。2.3質(zhì)譜(massspectrometry,MS)質(zhì)譜以質(zhì)量分析為基礎(chǔ),可提供化合物的分子量以及一些結(jié)構(gòu)信息。1980年代以后發(fā)展了許多新的“軟電離”技術(shù),使其在蛋白質(zhì)多肽分析中的應(yīng)用越來(lái)越廣。目前應(yīng)用較多的有原子轟擊、電噴霧和基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜。質(zhì)譜測(cè)序是對(duì)Edman降解的一個(gè)很好補(bǔ)充,它可對(duì)N2端封閉的多肽進(jìn)行測(cè)序;并可以通過(guò)碰撞誘導(dǎo)斷裂(CID)得到部分至完全的序列信息后,作出MS2肽譜,這可對(duì)修飾的氨基酸殘基定性,并確證其位置。而且質(zhì)譜技術(shù)與分離技術(shù)如HPLC、HPCE直接相連可相互驗(yàn)證,同時(shí)還可對(duì)混合肽進(jìn)行測(cè)序。2.3.1快原子轟擊質(zhì)譜(fastatombombardment2massspectrometry,FAB2MS)FAB2MS克服了傳統(tǒng)質(zhì)譜中樣品必須加熱氣化的限制,可對(duì)熱不穩(wěn)定、難揮發(fā)的蛋白質(zhì)多肽進(jìn)行分析。與其他質(zhì)譜技術(shù)相比,FAB2MS更適合于小分子多肽的檢測(cè)[6]。FAB2MS測(cè)定肽的氨基酸序列具有用量少、方便和快速的優(yōu)點(diǎn)。一些寡肽,特別是人工合成的有保護(hù)基的寡肽在遇到N2端封閉不宜用氨基酸序列儀測(cè)定其結(jié)構(gòu)的情況下,有可能用少量樣品采用FAB2MS直接獲得寡肽的分子量和氨基酸序列。俞振培等[7]用FAB2MS對(duì)7個(gè)帶有不同保護(hù)基的3～5肽成功地進(jìn)行了氨基酸序列研究。串聯(lián)FAB2MS將第一次轟擊得到的分子離子進(jìn)行再一次惰性原子轟擊,使肽鏈在不同部位斷裂,從而得到一組片段的質(zhì)譜信息,2.3.2電噴霧質(zhì)譜(electrosprayionization2massspectrometESI2MS由于可以產(chǎn)生多電荷峰,與傳統(tǒng)質(zhì)譜相比擴(kuò)大了檢測(cè)的分子質(zhì)量范圍,提高了靈敏度,可以得到準(zhǔn)確的分子量。ESI2MS可分為正離子和負(fù)離子,一般多肽和蛋白質(zhì)的ESI2MS分析總是以正離子方式進(jìn)行。ESI2MS的最大優(yōu)勢(shì)是可直接與HPLC、HPCE聯(lián)用,能在多肽酶解后得到HPLC或HPCE肽譜的同時(shí)得到一張精確的質(zhì)量肽譜(肽譜和質(zhì)譜的結(jié)合稱為質(zhì)量肽譜)。ESI2MS在質(zhì)量肽譜圖中能得到分子量低于400u的小分子肽段,可以鑒定一些在其他質(zhì)量肽譜圖中不能區(qū)分的肽譜[9]。在質(zhì)量肽譜中應(yīng)用ESI2MS可提供一種快速證實(shí)多肽氨基酸序列的方法。ESI2MS所產(chǎn)生的多電荷離子特別適用于串聯(lián)質(zhì)譜分析,用來(lái)檢測(cè)目標(biāo)肽段,可得到完全的序列信息。王賢純等[10]運(yùn)用串聯(lián)ESI2MS解析出7肽及其修飾產(chǎn)物、10肽、20肽的氨基酸序列。2.3.3基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrix2assistedlaserdesorptionionization2massspectrometry,MALDI2MS)MALDI2MS克服了直接用激光解吸離子化的缺陷,為分析非揮發(fā)性、熱不穩(wěn)定的大分子提供了一種較好的離子化方式。它的最大優(yōu)點(diǎn)是允許樣品中含有幾百毫摩爾的緩沖液及表面活性劑,且靈敏度比別的離子化方式高,可至fmol級(jí)[11]。能有效地分析較復(fù)雜的肽混合物,特別適合混合蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)相對(duì)分子量的精確測(cè)定。周紅華等[12]用基質(zhì)輔助紅外激光解吸質(zhì)譜法確證了3種寡肽的一級(jí)結(jié)構(gòu),為測(cè)定寡肽的分子量和一級(jí)結(jié)構(gòu)提供了一個(gè)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法。2.4核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)NMR因圖譜信號(hào)的純數(shù)字化、過(guò)渡的重疊范圍過(guò)寬和信號(hào)弱等原因,以往在多肽物質(zhì)的分析中應(yīng)用不多。隨著二維、三維以及四NMR的應(yīng)用,分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的發(fā)展,NMR逐漸成為此類物質(zhì)分析的主要方法之一。NMR可用于氨基酸序列、定量混合物中各組分組成含量等的分析中。NMR在分析少于30個(gè)氨基酸的小肽時(shí)是非常有用的,可以達(dá)到快速準(zhǔn)確分析的目的[13]。Lindon等[14]HPLC2NMR聯(lián)用,在連續(xù)流動(dòng)模式下對(duì)27個(gè)合成的多肽混合物進(jìn)行了分離和鑒別,快速得到了各多肽的結(jié)構(gòu)。2.5肽譜分析(peptidemapping)肽譜分析是多肽藥物質(zhì)量控制的重要手段。肽譜對(duì)每一種多肽藥物來(lái)說(shuō)都是特征、專一的。通過(guò)肽譜分析可以鑒別多肽,預(yù)測(cè)其一級(jí)結(jié)構(gòu)特征,比較功能相近多肽結(jié)構(gòu)的類似性和各批產(chǎn)品一級(jí)結(jié)構(gòu)的一致性。肽譜分析根據(jù)多肽分子量大小以及氨基酸組成特點(diǎn),使用專一性較強(qiáng)的蛋白水解酶(一般為肽鏈內(nèi)切酶)作用于特殊的肽鏈位點(diǎn),將多肽裂解成較小片段,通過(guò)一定的分離檢測(cè)手段得到特征性的指紋圖譜。肽譜分析對(duì)于蛋白質(zhì)多肽的結(jié)構(gòu)和特性鑒別具有重要意義,已成為許多蛋白質(zhì)多肽藥物質(zhì)量控制的重要方法[15]。2.5.1凝膠電泳(PAGE)雙向電泳、等電聚焦電泳等凝膠電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)多肽的純度、雜質(zhì)檢查以及分子量、等電點(diǎn)、含量測(cè)定等方面發(fā)揮了重要作用。雙向電泳作為蛋白質(zhì)組研究的三大關(guān)鍵核心技術(shù)之一,仍然是目前分析組分復(fù)雜蛋白質(zhì)分辨率最高的工具。對(duì)于分子量大于10ku的蛋白質(zhì),凝膠電泳技術(shù)已日臻完善;而對(duì)于分子量小于10ku的小分子多肽分析總是不盡人意。銀染SDS2PAGE微量肽圖法適于CNBr裂解的較大肽片段的分離檢測(cè),而對(duì)酶裂解的肽段,由于其分子較小,檢測(cè)效果不佳[16,17]。隨著生物檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展,本法逐漸被靈敏度更高的肽譜分析方法所替代。2.5.2HPLC由于HPLC分辨率及檢測(cè)靈敏度較凝膠電泳高得多,當(dāng)多肽藥物經(jīng)作用于特殊肽鏈位點(diǎn)的蛋白酶裂解,得到一系列的肽片段后,可用HPLC有效地鑒定基因工程產(chǎn)品、天然產(chǎn)品以及有關(guān)的雜質(zhì)。楊化新等[18]通過(guò)RP2HPLC法采用C18柱,檢測(cè)了經(jīng)胰蛋白酶裂解的多種重組人大降低了質(zhì)譜信號(hào)的專屬性。盡管LC-MS在蛋白多肽藥物的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中還存在一定的難度，但其作為實(shí)用性強(qiáng)，前景好的領(lǐng)域已引起人們的廣泛關(guān)注。1.4.2高效毛細(xì)管電泳（HPCE）HPCE是離子或荷電粒子以電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，在毛細(xì)管中按其濃度和分配系數(shù)不同進(jìn)行高效，快速分離的新技術(shù)，它以高分辨率，高靈敏度，分析時(shí)間短，樣品量少及操作簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn)而成為蛋白多肽生物分子分離分析的重要手段。在臨床上，生物體液中低濃度蛋白多肽的分析面臨的問(wèn)題有：蛋白多肽與毛細(xì)管壁的相互作用所引起的遷移時(shí)間的改變，這可以通過(guò)涂層CE加以改善；由于毛細(xì)管很細(xì)，管內(nèi)容積很小，進(jìn)樣量的不易控制給實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性帶來(lái)影響，而且很可能無(wú)法對(duì)低濃度的樣品提供足夠的靈敏度。國(guó)外根據(jù)樣品的性質(zhì)采用不同的預(yù)處理，大體上可分為非特異性和高親和性兩種，將樣品加以濃縮，取得了滿意的效果[15]。HPCE在檢測(cè)上的迅速發(fā)展與HPLC已有并駕齊驅(qū)之勢(shì)，況且鑒于HPCE在樣品微量分析的優(yōu)越性，已有人在藥物動(dòng)力學(xué)研究、體內(nèi)分析中，將微透析連續(xù)采樣與之聯(lián)用[16]，這在整個(gè)藥動(dòng)學(xué)研究中都不失為一有希望的方向。由以上可知，現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展給蛋白多肽類藥物的研究提供了多樣的分析手段，但鑒于該類藥物的特殊性，尚無(wú)一種方法能完全滿足動(dòng)力學(xué)研究的要求。根據(jù)人用藥物注冊(cè)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）對(duì)生物藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)“在科學(xué)基礎(chǔ)上的靈活性和具體情節(jié)個(gè)別處理”的總則，人們通常將幾種方法聯(lián)合應(yīng)用，互相補(bǔ)充，才能得到比較可靠的結(jié)果。應(yīng)用隨著一些高科技手段在多肽藥物中的應(yīng)用，作為基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，多肽比氨基酸更易吸收，生物利用度高。蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物除了作為營(yíng)養(yǎng)品滿足人體生長(zhǎng)發(fā)育的需要外，還具備特殊的生理調(diào)節(jié)功能，這些功能往往不能用原食品的氨基酸組成來(lái)解釋。功能性多肽是將大分子蛋白質(zhì)應(yīng)用生物技術(shù)切割而成，切割以后的小分子蛋白質(zhì)片段，可以產(chǎn)生原蛋白質(zhì)所沒(méi)有生理調(diào)節(jié)功能。由于多肽本身是小分子物質(zhì)，多肽的免消化、直接吸收的營(yíng)養(yǎng)特性，可以提高功效和減輕胃腸道的消化負(fù)擔(dān)，對(duì)于消化功能不好的人群具有極其明顯的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí):功能肽不僅能提供人體生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且具有特殊的生理學(xué)功能;可以降低血脂、延緩衰老、美體養(yǎng)顏、抗氧化、抗憂郁、抗疲勞、改善睡眠、增強(qiáng)記憶、抑制腫瘤等;能促進(jìn)人體對(duì)蛋白質(zhì)，維生素及各種有益微量元素的吸收［34－36］。生物活性肽的開(kāi)發(fā)應(yīng)用是當(dāng)前生物工程領(lǐng)域的熱門(mén)課題，其廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、食品、化妝品等行業(yè)［37］，正在形成具有廣闊前景的新產(chǎn)業(yè)。2