鼠傷寒沙門氏菌試驗(Ames試驗)文獻(xiàn)綜述

文獻(xiàn)綜述：鼠傷寒沙門氏菌試驗(Ames試驗)摘要：食品安全無論如何怎樣強(qiáng)調(diào)都不會過分，迅速而準(zhǔn)確地檢測致癌物質(zhì)是食品安全問題的重要方面。美國科學(xué)家Dr.BruceAmes及其同事創(chuàng)立了一種方法，叫鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗(Ames試驗)，它是利用一組組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株加入待測物在有或沒有微粒體活化系統(tǒng)條件下，發(fā)生回復(fù)突變的特征鑒定化學(xué)物質(zhì)的誘變活性，現(xiàn)已成為初步篩選化學(xué)物潛在致突變的首選方法。關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門氏菌試驗；基本原理；一般步驟；應(yīng)用及其研究進(jìn)展；1前言污染物對人體的潛在危害，引起人們的普遍關(guān)注。世界上已發(fā)展了百余種短期快速測試法，檢測污染物的遺傳毒性效應(yīng)。美國科學(xué)家Dr.BruceAmes等經(jīng)十余年努力，于1975年建立并不斷發(fā)展完善的沙門氏菌回復(fù)突變試驗(亦稱Ames試驗)已被世界各國廣為采用。該法比較快速、簡便、敏感、經(jīng)濟(jì)，且適用于測試混合物，反映多種污染物的綜合效應(yīng)。眾多學(xué)者有的用Ames試驗檢測食品添加劑、化妝品等的致突變性，由此推測其致癌性;有的用Ames試驗檢測水源水和飲用水的致突變性(比如，美國派斯凈水器就通過了Ames試驗)，探索較現(xiàn)行方法更加衛(wèi)生安全的消毒措施；或檢測城市污水和工業(yè)廢水的致突變性，結(jié)合化學(xué)分析，追蹤污染源，為研究防治對策提供依據(jù)；有的檢測土壤、污泥、工業(yè)廢渣堆肥、廢物灰燼的致突變性，以防止維系生命的土壤受致突變物污染后，通過農(nóng)作物危害人類檢測氣態(tài)污染物的致突變性，防止污染物經(jīng)由大氣，通過呼吸對人體發(fā)生潛在危害；用Ames試驗研究化合物結(jié)構(gòu)與致變性的關(guān)系，為合成對環(huán)境無潛在危害的新化合物提供理論依據(jù)；檢測農(nóng)藥在微生物降解前后的致突變性，了解農(nóng)藥在施用后代謝過程中對人類有無隱患；還有用Ames試驗篩選抗突變物，研究開發(fā)新的抗癌藥等等［1］。2定義回復(fù)突變(Reversemutation)細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。基因突變(Genemutation)在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。堿基置換突變(Basesubstitutionmutation)引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個嘌吟被另一嘌吟所代替。顛換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘌吟所替代，或一個嘌吟被另一嘧啶所代替。移碼突變(Frameshiftmutation)引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。鼠傷寒沙門氏菌/回復(fù)突變試驗(Salmonellatyphimurium/reversemutationassay)利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗菌株測定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的組氨酸缺陷型(his-)轉(zhuǎn)變?yōu)樵B(yǎng)型(his+)回復(fù)突變的試驗方法。3原理鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長。假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)

型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。即利用是否能引起鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型（his一）菌株的回復(fù)突變來判斷化學(xué)物質(zhì)是否誘變劑和致癌劑，并能區(qū)別突變的類型（置換或移碼突變）。（如圖a圖b[2]所示）需要說明的是：某些化學(xué)物質(zhì)需經(jīng)代謝活化才有致變作用，而細(xì)菌沒有這種酶系統(tǒng)，故在測試系統(tǒng)中加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S9混合液，可彌補(bǔ)體外試驗缺乏代謝活化系統(tǒng)之不足，同時增加檢測的靈敏度。圖a圖b圖a圖b注：圖a和圖b分別為未加入致突變物質(zhì)的培養(yǎng)皿和加入致突變物質(zhì)的培養(yǎng)皿，兩培養(yǎng)皿中的菌株均為鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his~）菌株?？梢钥闯?，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)胞外，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見到的微菌落 （圖a）。而在受誘變劑作用后，大量細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見的菌落（圖 b）。鑒于化學(xué)物質(zhì)的致突變作用與致癌作用之間密切相關(guān)，故此法現(xiàn)廣泛應(yīng)用于致癌物的篩選。4試驗前的準(zhǔn)備工作4.1儀器與設(shè)備培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱-80°C）或液氮生物容器、普通冰箱、天平（精密度O.lg和O.OOOlg）、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計數(shù)器、低溫高速離心機(jī)，玻璃器皿等。4.2試驗菌株采用TA97、TA98、TA100和TA102一組標(biāo)準(zhǔn)測試菌株。生物學(xué)特性鑒定新獲得的或長期保存的菌種，在試驗前必須進(jìn)行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。表1試驗菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)菌株組氨酸脂多糖屏氨芐青霉切除修復(fù)四環(huán)素自發(fā)回變?nèi)毕菡先睋p素抗性缺損抗性菌落數(shù)*TA97++++-90-180TA98++++-30-50TA100++++-100-200TA102+++-+240-320*在體外代注+衣示需要組氨酸“+”表示具有rfa突變“+”表示具有R因子“+”表示具有厶uvrB“+”表示具有pAQ1謝活化條件下自發(fā)突變質(zhì)?；刈兙鋽?shù)略增

4.3大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S9的制備4.3.1誘導(dǎo)最廣泛應(yīng)用的大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物），選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導(dǎo)劑，劑量為500mg/kg體重。誘導(dǎo)劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL。苯巴比妥鈉和0萘黃酮結(jié)合也可作為誘導(dǎo)劑。4.3.2S9制備動物誘導(dǎo)后第五日斷頭處死。處死前12h停止飲食，但可自由飲水。首先，用75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟,去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的0.15mol/L氯化鉀溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化鉀溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化鉀溶液3mL。用電動勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機(jī)上，在4°C條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S9）分裝于塑料管中。每管裝2mL~3mL。儲存于液氮生物容器中或-80C冰箱中備用。上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進(jìn)行。制備肝S9所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。s9制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定。4.4溶劑的選擇如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水作為溶劑；如為脂溶性，應(yīng)選擇對試驗菌株毒性低且無致突變性的有機(jī)溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為1001。4.5劑量的設(shè)計決定受試物最高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對細(xì)菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存活數(shù)減少，都是毒性的標(biāo)志。對原料而言，一般最咼劑量組可為5mg/皿。對產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，最咼劑量可為最低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)四個劑量組。每個劑量均做三個平行平板。5試驗操作一般步驟5.1增菌培養(yǎng)取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL,加入無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37C振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于1?2x109活菌數(shù)。5.2平板摻入法實驗時，將含0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45C水浴中保溫，然后每管依次加入試驗菌株增菌液0.1mL，受試物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37C培養(yǎng)箱里孵育48h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。（參見圖c）圖c鼠傷寒沙門氏菌試驗過程實驗中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應(yīng)同時設(shè)空白對照、溶劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷記錄受試物各劑量組、空白對照（自發(fā)回變）、溶劑對照以及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。如果受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系者，則該受試物判定為致突變陽性。受試物經(jīng)上述四個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌株，無論在加s9或未加s9條件下為陽性，均可報告該受試物對鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性。如果受試物經(jīng)四個試驗菌株檢測后，無論加s9和未加s9均為陰性，則可報告該受試物為致突變陰性。Ames試驗的應(yīng)用Ames試驗對特殊用途化妝品致突變性的研究[3]廣東省疾病預(yù)防控制中心的何冬梅、王建、嚴(yán)紀(jì)文等人采用鼠傷寒沙門菌/回復(fù)突變試驗檢測染發(fā)類育發(fā)類、美乳類及健美類等特殊用途化妝品的致突變性。其結(jié)果為：在受試的237份特殊用途化妝品中，染發(fā)劑的陽性率為3182%，且陽性者均為氧化型染發(fā)劑。育發(fā)類、美乳類及健美類產(chǎn)品均未出現(xiàn)致突變陽性。染發(fā)劑主要引起試驗菌株TA97、TA98、TA100回變率明顯升高，引起試驗菌株回變率升高的劑量范圍是125?5000口g/皿。該試驗的結(jié)論：部分染發(fā)類產(chǎn)品具有致突變作用，可對健康產(chǎn)生危害。Ames試驗在水質(zhì)檢測方面的應(yīng)用[4]廣州市自來水公司的林朝暉質(zhì)采用Ames試驗，對珠江流域主要取水點(diǎn)的水源水和對應(yīng)自來水中的有機(jī)致突變物污染情況進(jìn)行了研究。研究表明，部分取水點(diǎn)的有機(jī)致突變物污染較嚴(yán)重，并且氯化消毒后自來水的致突性大于水源水的致突性。因而，加強(qiáng)飲水中致突變物質(zhì)的檢測，改進(jìn)凈水消毒劑和凈水流程很有必要。甘藍(lán)紅色素的毒理學(xué)試驗研究[5]云南省疾病預(yù)防控制中心的耿菊敏、秦光和劉敏等人按衛(wèi)生部GB15193-1994食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法進(jìn)行了①急性經(jīng)口毒性試驗；②鼠骨髓細(xì)胞微核試驗；③小鼠精子畸形試驗；④Ames試驗；⑤30d喂養(yǎng)試驗以及⑦致畸試驗等多項試驗來研究甘藍(lán)紅色素的安全性。其中Ames試驗未見明顯毒性反應(yīng)。展望Ames試驗的優(yōu)缺點(diǎn)Ames試驗的優(yōu)點(diǎn)是，方法靈敏，檢出率高，經(jīng)試驗有90％的化學(xué)致癌物經(jīng)都可獲得陽性結(jié)果；加之方法比較簡便、易行，不需特殊器材，容易推廣。但是Ames試驗也存在這缺陷。其缺點(diǎn)是，微生物的DNA修復(fù)系統(tǒng)比哺乳動物簡單，基因不如哺乳動物多，不能完全代表哺乳動物的實際情況。同時，據(jù)文獻(xiàn)報道，應(yīng)用Ames試驗平扳摻入法嚴(yán)重不足之點(diǎn)是被測化學(xué)物、S9液、組氨酸加進(jìn)頂層后可能擴(kuò)散到底層去，它們的濃度有隨時間延長而下降的趨勢，從而影響實驗結(jié)果，如要提高測試物濃度，其毒性可能威脅細(xì)菌的生存。Ames試驗的改進(jìn)盡管如此，由于存在著上述的優(yōu)勢，故目前在致突變試驗中占重要位置，為首選的試驗方法。與此同時，不少同仁也結(jié)合其他的方法，使得Ames試驗的結(jié)果更加精確可靠。比如，華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李偉民、孫峰、米琴等人采用生物發(fā)光檢測法進(jìn)行Ames試驗的研究⑸即他們將自行構(gòu)建的含有青海弧菌熒光酶基因的質(zhì)粒pACYCL184引入Ames試驗的4個菌株TA97、TA98、TA100、TA102中，構(gòu)建成能夠生物發(fā)光的工程菌，分別命名為TAL97、TAL98、TAL100、TAL102。實驗表明，該4株工程菌保持原出發(fā)菌株所具有的與Ames試驗相關(guān)的性狀，對各類致突變劑有良好的反應(yīng)，且可用平皿計數(shù)法進(jìn)行致突變試驗。其發(fā)光值與致突變劑濃度存在良好的量效關(guān)系，故可用發(fā)光檢測取代原Ames試驗的平皿計數(shù)，使檢測更簡單、方便、快速。再比如，黃燕、鐘振國、羅沛等人在蒲葵子提取物致突變試驗中使用了兩種Ames試驗方法來研究該方法的靈敏度⑹。即是說對蒲葵子用正丁醇浸提，他們用Ames試驗方法（摻入法）與彷徨試驗方法，對TA100鼠傷寒沙門氏菌株進(jìn)行致突變試驗。結(jié)果為兩種試驗方法結(jié)果顯示，蒲葵子正丁醇提取物在5—500口g/ml劑量范圍，以Ames試驗方法與彷徨試驗均檢測出陽性結(jié)果，而在0.025口g/ml與0.5口g/ml劑量下，彷徨試驗?zāi)軝z測出陽性結(jié)果，而Ames方法未檢測出陽性結(jié)果。結(jié)論在較低濃度時，彷徨試驗?zāi)軝z測出Ames試驗檢測不出的陽性結(jié)果，表明彷徨試驗靈敏度較Ames試驗高。彷徨試驗（Fluctuationtest）是由Green等（1976）發(fā)明的，經(jīng)Ames試驗的改良的一種方法。它用液體培養(yǎng)基代替固體培養(yǎng)基，以觀察培養(yǎng)管濁度或pH指示劑顏色的變化代替菌落計數(shù),用試管代替培養(yǎng)皿。通過直觀地對各試管中液體顏色變化的計數(shù)，再利用公式對組間進(jìn)行X2檢驗，其結(jié)果判定簡單、直觀、明確、可靠。其檢測效力已被許多研究者所證實。1978年Gatehouse將其改進(jìn)為彷徨試驗方法，通過了解到該方法與常用的篩選致突變物試驗Ames試驗（摻入法）比較，有如下的優(yōu)點(diǎn)：①有較高的敏感性，可以檢測出誘變性較弱的致突變物，從而避免因方法靈敏性較差而造成的假陰性結(jié)果。②樣品、試劑消耗量少，可同時進(jìn)行數(shù)個樣品的檢測。彷徨試驗所用菌株為TA100,該菌株可用來檢測點(diǎn)突變和移碼突變［刀，該菌株在無外源性組氨酸供給的情況下不能生長繁殖，但當(dāng)發(fā)生回復(fù)突變時則可在無外源性組氨酸供給的情況下生長繁殖。由于一些外源性化學(xué)物需經(jīng)體內(nèi)代謝活化才具有誘變活性或經(jīng)代謝而解毒，為了模擬哺乳動物對外源性物質(zhì)的體內(nèi)代謝活化過程，提高測試的準(zhǔn)確性，通常在Ames試驗中添加哺乳動物肝微粒體酶制劑（s9）作為外源性物質(zhì)代謝活化系統(tǒng)。彷徨試驗?zāi)軌蜢`敏、迅速地檢測到基因的突變情況，是基因突變檢測的主要方法之一。但彷徨