分析化學(xué) 第七章 吸光光度法

第七章吸光光度法第一節(jié)光學(xué)分析法概述第二節(jié)吸光度法的基本原理第三節(jié)顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇第四節(jié)測(cè)量條件的選擇第五節(jié)目視比色與分光光度計(jì)第六節(jié)吸光光度法的應(yīng)用基于物質(zhì)光學(xué)性質(zhì)(電磁輻射或物質(zhì)與輻射作用)而建立起來(lái)的分析方法稱之。吸收光譜分析、發(fā)射光譜分析光學(xué)分析法：在光(或能量)作用下，通過(guò)測(cè)定物質(zhì)產(chǎn)生(發(fā)射、吸收或散射)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定性、定量分析的方法。內(nèi)部能級(jí)變化.光譜分析法或光譜法非光譜分析法改變電磁波的傳播方向、速度等物理性質(zhì)進(jìn)行分析的方法。內(nèi)部能級(jí)不變化,僅電磁輻射性質(zhì)改變

分子光譜分析、原子光譜分析按作用物分:按能級(jí)躍遷方向：按波長(zhǎng)不同分：紅外、可見(jiàn)光、紫外光譜法等第一節(jié)光學(xué)分析法概述一、電磁輻射的二象性電磁輻射（電磁波，光是其中一種）：以巨大速度通過(guò)空間、不需要任何物質(zhì)作為傳播媒介的一種粒子流（能量）。一、電磁輻射的二象性：具有波、粒二象性波動(dòng)性：光的反射、折射、偏振、干涉衍射現(xiàn)象。微粒性：光的吸收、放射、光電效應(yīng)等現(xiàn)象。光子能量:E∝1/λ，λ↓E↑σ是波數(shù)，C=2.9979×108m/s光的波動(dòng)性一、電磁輻射的二象性電磁輻射（電磁波，光是其中一種）：以巨大速度通過(guò)空間、不需要任何物質(zhì)作為傳播媒介的一種粒子流（能量）。一、電磁輻射的二象性：具有波、粒二象性波動(dòng)性：光的反射、折射、偏振、干涉衍射現(xiàn)象。微粒性：光的吸收、放射、光電效應(yīng)等現(xiàn)象。光子能量:E∝1/λ，λ↓E↑σ是波數(shù)，C=2.9979×108m/s光的粒子性紫外--可見(jiàn)光在電磁波譜中的位置電磁輻射本質(zhì)是一樣的，區(qū)別在于頻率不一樣。按波長(zhǎng)不同排列起來(lái)就形成電磁波譜。

高能輻射區(qū)γ射線能量最高，來(lái)源于核能級(jí)躍遷

χ射線來(lái)自內(nèi)層電子能級(jí)的躍遷光學(xué)光譜區(qū)紫外光來(lái)自原子和分子外層電子能級(jí)的躍遷可見(jiàn)光紅外光來(lái)自分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷波譜區(qū)微波來(lái)自分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)及電子自旋能級(jí)躍遷無(wú)線電波來(lái)自原子核自旋能級(jí)的躍遷(10-3~10nm)(10nm~10μm)(0.1cm~1000m)二、電磁輻射區(qū)：γ射線→X射線→紫外光→可見(jiàn)光→紅外光→微波→無(wú)線電波10-20.1nm10nm102nm103nm0.1cm100cm1cm103m|||||||

波長(zhǎng)

短長(zhǎng)三、電磁波譜把電磁輻射按照波長(zhǎng)大小順序排列起來(lái)，就稱為電磁波譜。紫外光區(qū)和可見(jiàn)光區(qū)僅是電磁波譜中的一小部分。發(fā)射光譜法：物質(zhì)的原子、分子或離子在一定條件下，由低能態(tài)（基態(tài)）躍遷至高能態(tài)（激發(fā)態(tài)），再由高能態(tài)躍遷至低能態(tài)，同時(shí)產(chǎn)生電磁輻射，根據(jù)這種光譜而建立的分析方法稱為發(fā)射光譜法。吸收光譜法：利用物質(zhì)對(duì)電磁輻射的選擇性吸收而建立的分析方法稱為吸收光譜法。紫外-可見(jiàn)分光光度法是其中重要的一種方法。(1)紫外分光光度法(UV):λ∈(200~400nm),用于有機(jī)物定性、定量、結(jié)構(gòu)分析。(2)可見(jiàn)分光光度法(Vis):λ∈(400~760nm),用于有色物質(zhì)定量分析。(3)紅外分光光度法(IR):λ∈(2.5~50μm),用于有機(jī)物結(jié)構(gòu)分析。(4)核磁共振譜(NMR)：原子核吸收無(wú)線電波，發(fā)生核自旋級(jí)躍

遷，產(chǎn)生光譜。用于分子結(jié)構(gòu)分析。從光本身來(lái)說(shuō)、有些波長(zhǎng)的光線，作用于眼睛引起了顏色的感覺(jué)，我們把人眼所能看見(jiàn)有顏色的光叫做可見(jiàn)光，其波長(zhǎng)范圍大約在400-760nm之間。實(shí)驗(yàn)證明：白光(日光、白熾電燈光、日光燈光等)是由各種不同顏色的光按一定的強(qiáng)度比例混合而成的。如果讓一束白光通過(guò)三棱鏡，就分解為紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫七種顏色的光，這種現(xiàn)象稱為光的色散。每種顏色的光具有一定的波長(zhǎng)范圍。我們把白光叫做復(fù)合光；把只具有一種顏色的光，叫做單色光。

實(shí)驗(yàn)還證明，不僅七種單色光可以混合成白光，如果把適當(dāng)顏色的兩種單色光按一定的強(qiáng)度比例混合，也可以成為白光。這兩種單色光就叫做互補(bǔ)色。如綠光和紫光互補(bǔ)，藍(lán)光和黃光互補(bǔ)，等等。第二節(jié)吸光光度法的基本原理一、單色光、復(fù)合光和互補(bǔ)色光白光

綠黃青橙色青藍(lán)紅藍(lán)紫400～450450～480480～490490～500500～580580～600600～650650～750

波長(zhǎng)在400～750nm的可見(jiàn)光：人的視網(wǎng)膜對(duì)此類光尤為敏感，且在此范圍內(nèi)不同波長(zhǎng)的光在視網(wǎng)膜中的顏色不同。其規(guī)律為：完全吸收完全透過(guò)吸收黃光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光藍(lán)光無(wú)色黑色物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系二、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收

如果我們把具有不同顏色的各種物體放置在黑暗處，則什么顏色也看不到。可見(jiàn)物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色與光有著密切的關(guān)系，一種物質(zhì)呈現(xiàn)何種顏色，是與光的組成和物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)的。1、物質(zhì)顏色的產(chǎn)生

對(duì)固體物質(zhì)來(lái)說(shuō)，當(dāng)白光照射到物質(zhì)上時(shí)，物質(zhì)對(duì)于不同波長(zhǎng)的光線吸收、透過(guò)、反射、折射的程度不同而使物質(zhì)呈現(xiàn)出不同的顏色。如果物質(zhì)對(duì)各種波長(zhǎng)的光完全吸收，則呈現(xiàn)黑色；如果完全反射，則呈現(xiàn)白色；如果對(duì)各種波長(zhǎng)的光吸收程度差不多，則呈現(xiàn)灰色；如果物質(zhì)選擇性地吸收某些波長(zhǎng)的光，那么，這種物質(zhì)的顏色就由它所反射或透過(guò)光的顏色來(lái)決定。物質(zhì)顏色產(chǎn)生物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有選擇性吸收而產(chǎn)生。即物質(zhì)的顏色是它所吸收光的互補(bǔ)色。為什么溶液呈黑色或白色呢?物質(zhì)的顏色光的互補(bǔ)規(guī)律對(duì)溶液來(lái)說(shuō)，溶液呈現(xiàn)不同的顏色，是由于溶液中的質(zhì)點(diǎn)(分子或離子)選擇性的吸收某種顏色的光所引起的。如果各種顏色的光透過(guò)程度相同，這種物質(zhì)就是無(wú)色透明的。如果只讓一部分波長(zhǎng)的光透過(guò)，其他波長(zhǎng)的光被吸收，則溶液就呈現(xiàn)出透過(guò)光的顏色，也就是溶液呈現(xiàn)的是與它吸收的光成互補(bǔ)色的顏色。例如硫酸銅溶液因吸收了白光中的黃色光而呈藍(lán)色；高錳酸鉀溶液因吸收了白光中的綠色光而呈現(xiàn)紫色。物質(zhì)對(duì)光吸收其實(shí)，任何一種溶液．對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收程度是不相等的。如果將某種波長(zhǎng)的單色光依次通過(guò)一定濃度的某一溶液，測(cè)量該溶液對(duì)各種單色光的吸收程度，以波長(zhǎng)為縱坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)可以得到一條曲線，叫做吸收光譜曲線或光吸收曲線。它清楚地描述了溶液對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收情況。圖7-2KMnO4溶液的吸收曲線

(cKMnO4：a<b<c<d)

2、吸收曲線在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，KMnO4溶液對(duì)波長(zhǎng)525nm附近的綠色光有最大吸收，而對(duì)紫色和紅色光則吸收很少。光吸收程度最大處的波長(zhǎng)，稱為最大吸收波長(zhǎng)，常用λ最大或λmax表示，任何可見(jiàn)光區(qū)內(nèi)、溶液的顏色主要是由這個(gè)數(shù)值決定的。在正常情況下，選用不同濃度的某種溶液，最大吸收波長(zhǎng)也是固定不變的，說(shuō)明光的吸收與溶液中物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)。圖7-2KMnO4溶液的吸收曲線

(cKMnO4：a<b<c<d)

·物質(zhì)的顏色的深淺與其吸收的強(qiáng)弱有關(guān)：吸收越強(qiáng)，顏色越深，由此可進(jìn)行化學(xué)分析。不同的物質(zhì)，λmax不同同一種物質(zhì)，λmax相同，但若濃度不同，吸收曲線的高度也不同據(jù)此可進(jìn)行定性分析據(jù)此即可進(jìn)行定量分析三、光吸收的基本定律—朗伯-比爾定律朗伯-比耳定律的推導(dǎo)

朗伯(Lambert)和比耳(beer)分別于1760年和1852年研究了光的吸收與有色溶液按層的厚度及溶液濃度的定量關(guān)系，奠定了分光光度分析法的理論基礎(chǔ)。當(dāng)一束平行單色光照射到任何均勻、非散射的介質(zhì)（固體、液體或氣體），例如溶液時(shí)，光的一部分被介質(zhì)吸收，一部分透過(guò)溶液、一部分被器皿的表面反射。如果入射光的強(qiáng)度為I0，吸收光的強(qiáng)度為Ia，透過(guò)光的強(qiáng)度為It，反射光的強(qiáng)度為Ir則它們之間的關(guān)系為

I0＝Ir+Ia+ItI0ItIaIr在分光光度測(cè)定中，盛溶液的比色皿都是采用相同質(zhì)且的光學(xué)玻璃制成的，反射光的強(qiáng)度基本上是不變的(一般約為入射光強(qiáng)度的4％)其影響可以互相抵消，于是可以簡(jiǎn)化為

I0＝It+Ia

純水對(duì)于可見(jiàn)光的吸收極微，故有色液對(duì)光的吸收完全是由溶液中的有色質(zhì)點(diǎn)造成的。當(dāng)入射光的強(qiáng)度I0一定時(shí)，如果Ia越大，It就越小，即透過(guò)光的強(qiáng)度越小，表明有色溶液對(duì)光的吸收程度就越大。

1、透射比和吸光度：T取值為0.0%~100.0%T=0.0%：光全吸收T=100.0%：光全透過(guò)②吸光度（吸收度）AT=ItI0×100%顯然，T↑，溶液吸收度↓；T↓，溶液吸收度↑。即透光率T反映溶液對(duì)光吸收程度，通常用1/T反映吸光度。A=lg1T=-lgT=lgI0ItA=-lgT,T=10-A

Ia

③T與A關(guān)系：IrA∝1/T，T=0，A=∞，T=100%，A=0透光率（透射比）：透過(guò)光的強(qiáng)度與入射光的強(qiáng)度的比值，常用“T”表示：2、光吸收定律（1）朗伯—比爾定律：

當(dāng)一平行的單色光垂直通過(guò)某一均勻

非散射的吸光物質(zhì)時(shí)，其吸光度A于相應(yīng)物質(zhì)的濃度C和吸收層度（b）成正比：波長(zhǎng)相同或相近溶液(顯然要求物質(zhì)的顆粒小)光通過(guò)時(shí)不產(chǎn)生散射，而是饒其而過(guò)有色物質(zhì)當(dāng)一束平行的單色光通過(guò)液層厚度一定的溶液時(shí)，在入射光波長(zhǎng)、強(qiáng)度和溶液溫度等不變時(shí)，吸光度Ａ與溶液濃度c關(guān)系：比耳定律實(shí)驗(yàn)Ａ＝kc當(dāng)一束平行的單色光通過(guò)濃度一定的溶液時(shí)，在入射光波長(zhǎng)、強(qiáng)度和溶液溫度等不變時(shí)，吸光度Ａ與液層厚度Ｌ（b）關(guān)系：朗伯定律實(shí)驗(yàn)Ａ＝kLA：吸光度B：吸收層厚度C：吸光物濃度K：比列系數(shù)

此即為朗伯—比爾定律（光吸收定律）

式中：式中，濃度C的單位有兩種表示方法：1、以質(zhì)量濃度（g·L-1）為單位，相應(yīng)K稱為吸收系數(shù)用“a”表示，則：A=abc2、以物質(zhì)的量濃度（mol·L-1）為單位，相應(yīng)K稱為摩爾吸收系數(shù)，用“κ”表示，則：

較常用，下面的討論均為此種關(guān)系A(chǔ)=κbc注意：

1、吸光度A是無(wú)單位的量，故κ的單位為：

L·mol-1·cm-12、κ的物理意義：指當(dāng)吸收層厚度為1cm，濃度為

1mol·L-1時(shí)對(duì)應(yīng)的吸光度；κ與濃度、厚度無(wú)關(guān)，只取決于波長(zhǎng)、物質(zhì)種類。分析中，在相關(guān)物質(zhì)濃度一定時(shí)，為獲得較大的吸光度（A），應(yīng)找出其最大吸收波長(zhǎng)λmax，在此條件下分析。A最大，相應(yīng)的κ值也最大，記為κ

max。最大摩爾吸收系數(shù)不同的物質(zhì)，對(duì)光的吸收性能不同，其κ

max也不同。顯然，κ

max越大，在相同濃度下的吸收濃度越大。其測(cè)定的靈敏度也越高。即：

κ

max∝靈敏度。通常情況下，為獲得較好的測(cè)量效果，一般要求：κ

max＞104

L·mol-1·cm-1四、偏離朗伯—比爾定律的原因按朗伯—比爾定律，當(dāng)物質(zhì)一定，波長(zhǎng)一定，吸收層厚度一定時(shí)，A—c應(yīng)呈線性關(guān)系（如右圖）：

但實(shí)際中，關(guān)系曲線常有偏高、偏低兩種類型：

正偏差（A測(cè)＞A理）；負(fù)偏差（A測(cè)＜A理）。造成偏差的兩種原因有兩類：

物理因素和化學(xué)因素1、物理因素：

①光不純：朗伯—比爾定律要求入射光應(yīng)為單色光（具有確定波長(zhǎng)的光），且一般要求測(cè)定時(shí)的波長(zhǎng)為最大吸收波長(zhǎng)（λmax.κmax），但：若入射光不純，含有其他不同波長(zhǎng)的光，則此類光：∵不易被測(cè)物吸收，必然導(dǎo)致T，A，產(chǎn)生負(fù)偏差。

a.選擇好的分光器以獲得較純的單色光

b.即使再好的分光器，也難以獲得絕對(duì)意義上的單色光，但若混進(jìn)的光的κ與實(shí)測(cè)光的κ測(cè)相近，則對(duì)吸光度A不影響，若相差較大，需調(diào)整入射波長(zhǎng)，減小靈敏度，選擇影響較小的λ分析（見(jiàn)右圖）。解決方法：②入射光不平行：

測(cè)定時(shí)，是將被測(cè)溶液置于矩形的比色皿內(nèi)進(jìn)行測(cè)試（下圖），若入射光不平行，則難以保證光線垂直通過(guò)被測(cè)溶液，造成部分光線的光程增大（相當(dāng)于液層厚度↗）從而導(dǎo)致A增加，產(chǎn)生正偏差。解決方法：不平行光平行光不平行光使入射光嚴(yán)格平行通過(guò)吸收層（垂直于比色器的被照表面）③介質(zhì)不均勻：

若被測(cè)物為溶液，溶質(zhì)是分子或接近分子的離子狀態(tài)，顆粒很小，其直徑遠(yuǎn)小于可見(jiàn)光波長(zhǎng)，則入射光通過(guò)時(shí)將發(fā)生饋射而非散射，微粒對(duì)A無(wú)直接影響（吸收除外）。若被測(cè)物顆粒較大，入射光通過(guò)時(shí)將發(fā)生散射，使T減小，A增加，產(chǎn)生正偏差。解決方法：

測(cè)得的吸光度非物質(zhì)本身的吸收控制操作條件，使溶液澄清透明，避免生成膠體或產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象。2、化學(xué)因素：①溶液濃度過(guò)高：

使溶液中微粒之間的間隙減小，同時(shí)使溶質(zhì)間的相互作用增加，溶液的粘度增加，導(dǎo)致T較小，A增加，產(chǎn)生正偏差（這種改變與濃度增大時(shí)，被測(cè)物分子增大，吸光度增大毫不相關(guān)）。解決方法：稀釋，使被測(cè)液在較低濃度下進(jìn)行。②化學(xué)反應(yīng)：

通過(guò)解離、締合等形成其他化合物，使被測(cè)物的濃度C減小，A減小，產(chǎn)生負(fù)偏差。解決方法：

控制濃度、酸度，除去其它易反應(yīng)物質(zhì)，從而減小偏差。③比爾定律的局限性假定吸光質(zhì)子（分子或離子）之間是無(wú)相互作用。在稀溶液情況下使用第三節(jié)顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇

一、顯色反應(yīng)及影響因素：1、顯色反應(yīng)：

若被測(cè)物有色——可直接測(cè)其A；若無(wú)色，則需加入某種試劑使之顯色。此類試劑叫“顯色劑”，其反應(yīng)稱“顯色反應(yīng)”，可表示為：無(wú)色被測(cè)物+顯色劑顯色有機(jī)物其顯色機(jī)理有兩類：①氧化還原：

Mn2++S2O82-→MnO4-(紫紅)

過(guò)二硫酸鹽②絡(luò)合：

Mo5+(無(wú)色)＋5SCN-→Mo(SCN)5(橙紅)對(duì)顯色反應(yīng)的要求：①選擇性好②靈敏度要高③對(duì)比度要大顯色劑不與其它離子發(fā)生副反應(yīng)只需很少被測(cè)物即能顯出明顯顏色顯色劑與產(chǎn)物之間的顏色（波長(zhǎng)）相差較大（△λ在60nm以上，即顏色不同）否則難以分辨④有色物要穩(wěn)定，組成要恒定保證重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高⑤顯色條件易于掌握。2、顯色條件的選擇：①顯色劑的用量：

因顯色反應(yīng)可逆，故增大顯色劑用量，可使平衡右移，產(chǎn)物轉(zhuǎn)換徹底，A↑，準(zhǔn)確性和靈敏度均↑?！嘁话懔吭蕉啵珹越大，測(cè)量越靈敏。

但個(gè)別物質(zhì)，如Mo(SCN)n，顯色劑SCN-用量增大后，因生成配位數(shù)為6的絡(luò)合物［Mo(SCN)6-］，顏色反而變淺，A↓；ACn=5②溶液酸度：

若溶液中被測(cè)離子或顯色劑能與酸堿作用，則改變酸度即可改變產(chǎn)物濃度，使其吸光度和靈敏度發(fā)生變化解決方法：

讓顯色反應(yīng)在不同酸度下進(jìn)行，找出其最大吸收酸度，即得最適宜的酸度條件。ApHpHmax③顯色時(shí)間：

當(dāng)被測(cè)物與顯色劑通過(guò)顯色反應(yīng)生成有色產(chǎn)物后，按產(chǎn)物的穩(wěn)定情況可分幾種不同的類型：穩(wěn)定型：產(chǎn)物一旦產(chǎn)生，便非常穩(wěn)定（最理想的類型，可在t0以后測(cè)定）不穩(wěn)定型：產(chǎn)物形成后逐漸分解（不能用于吸光分析）半穩(wěn)定型：產(chǎn)物較穩(wěn)定，經(jīng)一段時(shí)間放置后才逐漸分解（應(yīng)抓緊時(shí)間在t1至t2測(cè)定）Att0Att1t2Att0

④溫度：

不同的顯色反應(yīng)需不同的溫度，有的常溫下即可進(jìn)行，有的需加熱，有的在高溫下要分解，故應(yīng)根據(jù)不同情況選擇適宜溫度。

⑤共存離子干擾：

a.共存離子與顯色劑生成有色物

消除方法：

掩蔽或分離

b.共存離子本身有顏色，且不易分離消除方法：適當(dāng)調(diào)整參比溶液，如用不加顯色劑的溶液為參比，將其參比調(diào)零，即可消除。三、顯色劑常用的顯色劑可分為無(wú)機(jī)顯色劑和有機(jī)顯色劑兩大類。無(wú)機(jī)顯色劑與金屬離子形成的配合物在穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性方面較差，一般較少使用，目前仍有一定實(shí)用價(jià)值的無(wú)機(jī)顯色劑僅有硫氰酸鹽、鉬酸銨、過(guò)氧化氫等幾種。更實(shí)用的是有機(jī)顯色劑，它能與金屬離子形成穩(wěn)定配合物，具有較高的靈敏度和選擇性。下表列出了幾種常用的顯色劑。一些常用的顯色劑試劑測(cè)定離子λmaxε反應(yīng)條件硫氰酸鹽Fe3+4800.1～0.8mol·L-1HNO3鉬酸鹽Si(Ⅳ)670～8200.15～0.3mol·L-1H2SO4過(guò)氧化氫Ti(Ⅳ)4201～2mol·L-1H2SO4鄰二氮菲Fe2+5121.1×104pH=2.0～9.0磺基水楊酸Fe3+5201.6×103pH=2.0～3.0二苯硫腙P(guān)b2+5207.0×104pH=8.0～10.0，CCl4萃取丁二肟Ni2+4701.3×104pH=11～12鉻天青（CAS）Al3+5455×104pH=4.7～6.0四、三元配合物三元混合配位配合物離子締合物三元膠束配合物第四節(jié)測(cè)量條件的選擇一、入射光波長(zhǎng)的選擇入射光波長(zhǎng)選擇的依據(jù)是吸收曲線，一般以最大吸收波長(zhǎng)λmax

為測(cè)量的入射光波長(zhǎng)。這是因?yàn)樵诖瞬ㄩL(zhǎng)處κ最大，測(cè)定的靈敏度最高，而且在此波長(zhǎng)處吸光度有一較小的平坦區(qū)，能夠減少或消除由于單色光的不純而引起的對(duì)朗伯-比爾定律的偏離，從而提高測(cè)定的準(zhǔn)確度。但若在

max處有共存離子的干擾，則應(yīng)考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長(zhǎng)。測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：

吸收最大的波長(zhǎng)為入射光，干擾最小三、選擇合適的參比溶液。為什么需要使用參比溶液？——測(cè)得的的吸光度真正反映待測(cè)溶液吸光強(qiáng)度。光蒸餾水被檢測(cè)樣顯色劑其它試劑干擾離子二、參比溶液的選擇根據(jù)待測(cè)組分的性質(zhì)，選擇合適的參比溶液，盡可能抵消各種共存有色物質(zhì)的干擾，使測(cè)得的吸光度真正反映待測(cè)組分的濃度。（1）溶劑參比如果僅待測(cè)物與顯色劑反應(yīng)的產(chǎn)物有色，而試劑與待測(cè)物均無(wú)色時(shí)，可用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤?，稱為溶劑空白。消除溶劑和比色皿等因素的影響二、參比溶液的選擇（2）試劑參比當(dāng)試樣溶液無(wú)色，而顯色劑及試劑有色時(shí)，可用不加試樣的顯色劑和試劑的溶液作參比溶液，稱為試劑空白。消除試劑和比色皿等因素的影響二、參比溶液的選擇（3）試樣參比當(dāng)試樣溶液有色，而試劑、顯色劑無(wú)色時(shí)，應(yīng)采用不加顯色劑的樣品溶液作參比溶液，稱為樣品空白。消除有色離子和比色皿等因素的影響參比溶液選擇的基本原則是參比溶液的吸收能扣除非待測(cè)組分的吸收。即：

A（試液）=

A（待測(cè)吸光物質(zhì)）＋

A（干擾）＋

A（池）

A（參比）=

A（干擾）＋

A（池）

例如顯色反應(yīng)M＋R=M-R

No.樣品溶液顯色試劑溶劑M-R參比溶液組成1無(wú)吸收無(wú)吸收無(wú)吸收吸收溶劑2有一定吸收無(wú)吸收無(wú)吸收吸收不加顯色試劑的樣品溶液3無(wú)吸收

有一定吸收無(wú)吸收吸收顯色試劑4有一定吸收有一定吸收無(wú)吸收吸收顯色試劑、樣品溶液及待測(cè)組分M的掩蔽劑儀器的測(cè)量誤差儀器的質(zhì)量引起的誤差讀數(shù)誤差如儀器不穩(wěn)定，顯示不靈敏等對(duì)儀器讀數(shù)表上的刻度讀數(shù)取不準(zhǔn)造成（盡管采用液晶顯示，但仍存在一定的顯色誤差）三、吸光度范圍的選擇

前一種誤差可通過(guò)檢修等方法提高質(zhì)量，而后一種則難以消除。一般來(lái)說(shuō)，讀數(shù)器上顯色均為透光度（由此換算為A）

通常情況下，讀數(shù)誤差△T＝0.002～0.01之間，取平均值：即每次顯示的T值均有0.005的誤差，且此值對(duì)0～1.0之間的每個(gè)T值均相同。

但是，因T與A、C均非線性而呈現(xiàn)對(duì)數(shù)關(guān)系，故在不同T所對(duì)應(yīng)的讀數(shù)誤差△T導(dǎo)致的吸光度A的差△A是不同的，由此造成的濃度△C也不同。何處的△A、△C最小？絕對(duì)誤差按關(guān)系:解出：微分：同除以C:

相對(duì)誤差以T對(duì)│Et│作圖，可得一向下彎曲的曲線，由此可見(jiàn)：①當(dāng)T＝0.15～0.70范圍內(nèi)，│Et│相對(duì)較小，故為獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果，應(yīng)使被測(cè)物T處在此范圍內(nèi)（相應(yīng)的吸光度A=0.15～0.80之間）；②曲線有一最低點(diǎn)，其對(duì)應(yīng)的：T=0.368，A＝0.434，此時(shí)讀數(shù)誤差引起的濃度誤差最小，結(jié)果最準(zhǔn)確。0.15

0.368

0.70(T)0.80

0.434

0.15(A)│Et│第五節(jié)目視比色與分光光度計(jì)一、目視比色法

是一種用眼睛辨別顏色深淺，以確定待測(cè)組分含量的方法。一般采用標(biāo)準(zhǔn)系列法。即在一套等體積的比色管中配置一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按同樣的方法配置待測(cè)溶液，待顯色反應(yīng)達(dá)平衡后，從管口垂直向下觀察，比較待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)系列中哪一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色相同，便表明二者濃度相等。如果待測(cè)試液的顏色介于某相鄰兩標(biāo)準(zhǔn)溶液之間，則待測(cè)試樣的含量可取兩標(biāo)準(zhǔn)溶液含量的平均值。

方法的特點(diǎn)

a利用自然光，無(wú)需特殊儀器;

b比較的是吸收光的互補(bǔ)色光;

c目測(cè)，方法簡(jiǎn)便，靈敏度高;

d準(zhǔn)確度低（一般為半定量）;

e不可分辨多組分。二、分光光度計(jì)由光源、單色器、吸收池、檢測(cè)系統(tǒng)四部分構(gòu)成。0.482光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示器0.482光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示器分光光度計(jì)原理721單束分光光度計(jì)吸收池又叫比色皿，是由質(zhì)料均勻的玻璃構(gòu)成，分0.5cm、1cm、2cm、3cm（均指池的厚度，即液層厚度）幾種規(guī)格。雖然無(wú)色透明，但仍有一定的吸光度（A池）。另外，雖然多數(shù)溶劑為水，表面無(wú)色透明，但也有一定的吸光度，用A劑表示。

若溶液中具有顏色的被測(cè)離子吸光度為A測(cè)，則當(dāng)一束光照射至比色皿及其內(nèi)部溶液時(shí)，總的吸光度為A總，則：

A總=A測(cè)+A池+A劑=A測(cè)+AR

雖然按朗伯—比爾定律，A測(cè)=κbc，但得到的卻非A測(cè)而為A總，若由其算C，須知AR。這樣就顯得復(fù)雜，解決方法是：解決方法（簡(jiǎn)化方法）：

先取同樣厚度的比色皿盛同樣的溶液（注意：不含被測(cè)離子），此類溶液稱“參比溶液”。用同樣波長(zhǎng)的光在相同條件下測(cè)定，其吸光度用“A參”表示。顯然：A參=A池+A劑=AR同樣條件下測(cè)定被測(cè)液：

A總=A測(cè)+A參

若人為的將參比液的吸光度調(diào)節(jié)為0（亦即T參=100%），此時(shí)：∵A參=0，則測(cè)得：

A總=A測(cè)=κbc

即可由測(cè)出的A總直接計(jì)算C。此項(xiàng)操作叫“參比調(diào)零”，是每一次測(cè)定前的必須操作由于吸光光度法是一種很靈敏的分析法（靈敏度可高達(dá)10－4～10－5%，萬(wàn)分之一或十萬(wàn)分之一的含量），故操作條件尤為關(guān)鍵，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)（針對(duì)比色皿）：①.各比色皿的規(guī)格和性能應(yīng)一致。②.使用時(shí)應(yīng)注意保持清潔。③.不要在比色皿上留下劃痕。④.比色皿在比色槽中的位置要固定。第六節(jié)吸光光度法的應(yīng)用兩方面：

最主要的應(yīng)用利用不同物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)λmax不同進(jìn)行分析；利用同一物質(zhì)在不同濃度下吸光度不同進(jìn)行分析。定性定量一、單組分分析：

又分單組分和多組分（兩種或兩種以上被測(cè)組分）。針對(duì)單組分：分析方法主要有兩種：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

當(dāng)溶液厚度一定，被測(cè)組分一定時(shí)，A與C呈現(xiàn)性關(guān)系，故此可用標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定被測(cè)組分濃度，具體步驟為：第一步：配制一系列含有同樣被測(cè)物且濃度不同（均已知）的溶液——標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下測(cè)出各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度：

C1、C2、…、Cn；

A1、A2、…、An。AC1C2

Cx

Cn

C第二步：以A為縱坐標(biāo)，C為橫坐標(biāo)作圖，可得到一直線——“標(biāo)準(zhǔn)曲線”。第三步：在同樣條件測(cè)未知液的吸光度（Ax），

圖上水平線與標(biāo)準(zhǔn)曲線之點(diǎn)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)Cx即為被測(cè)液的濃度。·【注意】：

①本法所依據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線系由一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定所得。顯然，標(biāo)準(zhǔn)溶液越多，越易在測(cè)量中減少偶然誤差的影響，結(jié)果越準(zhǔn)確，但過(guò)多時(shí)操作又較復(fù)雜，通常：n≥4；②測(cè)定條件下A與C不應(yīng)發(fā)生偏離，若有偏離（如C過(guò)大），應(yīng)取其直線部分進(jìn)行測(cè)定；③若因各種隨機(jī)誤差的影響，某些點(diǎn)不在同一直線上。應(yīng)上下兼顧，取其總的趨勢(shì)作一平滑直線（切忌作各點(diǎn)的折線）?；貧w方程例:用磺基水楊酸分光光度法測(cè)鐵，標(biāo)準(zhǔn)Fe3+溶液是由0.2160ｇNH4Fe(SO4)2·12H2O溶于水,定容為500mL制成。取此標(biāo)準(zhǔn)Fe3+溶液配制成下列系列，顯色并定容為50mL后測(cè)定吸光度，根據(jù)下列數(shù)據(jù)，繪制一條回歸線。待測(cè)試液是取50mL，稀釋成250mL，然后吸取此稀釋液2.00mL置50mL容量瓶中，在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同條件下顯色并稀釋至刻度。測(cè)定吸光度為0.555，求試液中鐵含量（g/L）。標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液V/mL0.002.004.006.008.0010.00吸光度A0.000.1650.3120.5120.6600.8542、比較法用一種已知準(zhǔn)確濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液cs，在一定條件下測(cè)定其吸光度As，然后在相同條件下測(cè)定試液cx，的吸光度Ax.二、示差分光光度法：

通常情況下測(cè)被測(cè)物的吸光度A時(shí)，均不會(huì)以被測(cè)組分的溶液作參比。令其A=0，此時(shí)A總＝A測(cè)＝κbc，

為確保測(cè)定誤差較小，均要求：

A總：0.15～0.80，但若被測(cè)物濃度較大，則將造成很多不利后果，表現(xiàn)在：①吸光度A值超出0.15～0.80范圍，出現(xiàn)較大的讀數(shù)誤差；②溶液的光學(xué)屬性與參比液相差很大，造成較大偏離；③吸光分度法雖然靈敏較高，但準(zhǔn)確度卻較差（測(cè)定誤差約為4％）——故多用于微量分析，而少用于高濃度的常量分析。

當(dāng)然，上述問(wèn)題可通過(guò)稀釋處理，但一者麻煩，再加上增加了一操作，誤差的可能性進(jìn)一步增大。為此，可采用示差分度法，其原理是：取一含被測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)液作參比（其濃度和被測(cè)液相近或略低于被測(cè)液），即：

Cs＜Cx

對(duì)參比溶液：AS＝κb·CS對(duì)被測(cè)溶液：AX＝κb·CX兩者相減：AX-AS＝κb（CX-CS）即：△A＝κ'b·△C

△A△C兩溶液的吸光度之差與濃度差成正比，此即示差法的基本原理

測(cè)定時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比，調(diào)節(jié)As＝0。然后，在同樣條件下測(cè)定被測(cè)液，測(cè)得的數(shù)值實(shí)為兩溶液的分差（示差吸光度），用Af表示：

Af＝△A＝κb·△C

上式中，只需知道κb，即可由Af算出△C，

再由：△C＝Cx－Cs，算出：Cx＝△C＋Cs

采用此法后，因縮小了參比液和被測(cè)液的濃度差，即可解決問(wèn)題①、②。

也可解決問(wèn)題③，原因：

當(dāng)濃度很大時(shí)，其透光度通常較小（小于0.15），若參比液的透光度As＝0，則其透光率必?cái)U(kuò)大為1.0（100％）——擴(kuò)大了10倍，在此情況下，被測(cè)液的吸光度液必將增大10倍，為0.5（即50％），這就擴(kuò)大了標(biāo)尺的讀數(shù)——準(zhǔn)確度也繼之增大了10倍，若原有分析誤差為4％，則采用此法后也就為0.4％。

不過(guò)，對(duì)被測(cè)組分，κb往往不知，為通過(guò)Af測(cè)確定CX，也可采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法：取一已知濃度，但濃度稍小于被測(cè)溶液的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比，調(diào)零：As＝0。

再配制一系列濃度（濃度較參比液大）較大的標(biāo)準(zhǔn)溶液，算出其和標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度差：

C1、C2、…、Cn△C1、△C2、…、△Cn

測(cè)出Af

：Af1、Af2、…、Afn

作圖如下，得一標(biāo)準(zhǔn)曲線：在同樣條件下測(cè)得被測(cè)液示差吸光度Afx

在圖中橫坐標(biāo)找出相應(yīng)點(diǎn)△CX：∴CX＝△CX＋CS

AfxAfnAfAf2Af1△C1C△C2△C△C物料中鐵含量測(cè)定

(鄰二氮菲分光光度法)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．掌握鄰二氮菲分光光度法測(cè)定微量鐵的方法原理。2．學(xué)會(huì)分光光度計(jì)的正確使用。721型分光光度計(jì)1.電流計(jì)2.波長(zhǎng)刻度盤3.波長(zhǎng)調(diào)節(jié)器4.零點(diǎn)調(diào)節(jié)器5.100%調(diào)節(jié)器6.比色皿定位拉桿7.靈敏度調(diào)節(jié)器8.電源開關(guān)9.指示燈10.光門拉桿11.比色皿暗箱本實(shí)驗(yàn)使用721型分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。其它型號(hào)的分光光度計(jì)使用方法可查看相應(yīng)的說(shuō)明書。二、實(shí)