TZNZ 201-2023 水稻對泛菌葉枯病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01CCSB15

T/ZNZT/ZNZ201—2023水稻對泛菌葉枯病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程Technicalcodeofpracticeforidentificationofriceresistancetoleafblight2023-08-30發(fā)布 2023-09-30實施浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學(xué)會 發(fā)布T/ZNZ201T/ZNZ201—2023II前??言本文件按照GB/T1.1—20201草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學(xué)會提出并歸口。本文件起草單位：中國水稻研究所。本文件主要起草人：侯雨萱、梁燕、季芝娟、曾宇翔、萬品俊。T/ZNZ201T/ZNZ201—2023PAGEPAGE10水稻對泛菌葉枯病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件適用于水稻種質(zhì)資源、品種（品系）等材料對水稻泛菌葉枯病的抗性鑒定。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB4404.11部分：禾谷類GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T8321（所有部分）496NY/T1276農(nóng)藥安全使用規(guī)范總則NY/T4248水稻生產(chǎn)全程質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。水稻泛菌葉枯病 leafblightofrice主要由菠蘿泛菌（Pantoeaananatis）引起的水稻細(xì)菌性病害。注：菠蘿泛菌的生物學(xué)特性和水稻上的危害癥狀見附錄A。試劑與材料本文件所用試劑在未加說明時均采用分析純試劑。實驗室用水應(yīng)符合GB/T6682中規(guī)定的三級水要求。培養(yǎng)基PSA10g，L-1g10g15液體培養(yǎng)基無需添加1000mL，pH7.0，高壓滅菌（121℃，20min）。M210485g，MgSO4?7H2O0.3g15液體培養(yǎng)基無需加）1000mL，pH7.0，高壓滅菌（121℃，20min）。消毒液75%的酒精：酒精原液750mL，用去離子水定容至1000mL。1%的次氯酸鈉溶液：次氯酸鈉原液10mL，用去離子水定容至1000mL。3%雙氧水：30%雙氧水100mL，用去離子水定容至1000mL。設(shè)施和設(shè)備人工鑒定室溫度：15℃~35℃，濕度：≥50%，且可補(bǔ)燈光的溫室。超凈工作臺潔凈等級：100級@≥0.5μm，平均風(fēng)速：0.25m/s~0.6m/s。高壓滅菌鍋溫度范圍：0℃~135℃，滅菌時間范圍：4min~120min，最高工作壓力：0.22MPa~0.25MPa。恒溫培養(yǎng)箱溫度范圍：0℃~50℃，溫度波動：+1℃。超低溫保存箱溫度范圍：-86℃~10℃，溫度波動：+1℃。振蕩搖床溫度范圍：0℃~50℃，溫度波動：+1℃，振動頻率：0rpm~300rpm，振動幅度：20mm。光學(xué)顯微鏡目鏡：10×；物鏡：10×、40×。PCR普通電泳儀凝膠成像系統(tǒng)電子天平感量0.01g。分光光度計波長范圍190nm~1100nm。鑒定程序按圖1進(jìn)行。圖1水稻對泛菌葉枯病抗性鑒定流程圖接種體制備接種體選擇根據(jù)試驗需要選取當(dāng)?shù)刂虏×?qiáng)的菌株作為接種體，菌株分離鑒定和保存方法見附錄A。接種體繁殖、制備取-801:1000M21028℃，200rpm的條16h~24hOD6000.5，作為接種體備用。鑒定材料的種植種子質(zhì)量應(yīng)符合GB4404.1常規(guī)稻或雜交稻一級種標(biāo)準(zhǔn)，不應(yīng)帶檢疫性病蟲。鑒定設(shè)計50B136株。鑒定材料育苗3%242430℃的恒0.5cm時，將出芽一致的種子播種于塑料盆中，種子之間的株行距約16cmx16cm1cm20℃~28℃，自然光照下育苗。鑒定材料管理NY/T496NY/T4248GB/T8321、NY/T1276的規(guī)定。鑒定材料在全生育期內(nèi)不使用殺菌劑。接種接種時期水稻劍葉完全展開時。接種方法接種采用剪葉和噴霧法。先用剪刀蘸取菌液，剪除劍葉頂端2cm~3cm；隔1天后，裝滿菌液的塑63片~53OD6000.5。接種后管理90%h/10h光暗交替的溫室內(nèi)繼續(xù)生長。病情調(diào)查調(diào)查時間接種后約4周。調(diào)查與記載62C的表C.1?？共⌒栽u價病情級別劃分依據(jù)鑒定材料葉片上的發(fā)病程度，進(jìn)行病情分級，病情級別及其對應(yīng)的癥狀描述見表1。表1水稻泛菌葉枯病病情級別病情級別病情0級無明顯病斑1級病斑面積小于接種葉片總面積的10%3級病斑面積達(dá)到接種葉片總面積的10%，小于20%5級病斑面積達(dá)到接種葉片總面積的20%，小于40%7級病斑面積達(dá)到接種葉片總面積的40%，小于60%9級病斑面積達(dá)到接種葉片總面積的60%及以上病情指數(shù)計算DI(BiBd)100 （1）MMdDI—病情指數(shù)；Bi—各病情級別的稻葉數(shù)；Bdd—（此處為9?？共⌒栽u價標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)鑒定材料3次重復(fù)的病情指數(shù)（DI）平均值確定其對水稻泛菌葉枯病的抗性水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)見表2。表2水稻對泛菌葉枯病抗性評價標(biāo)準(zhǔn)病情指數(shù)（DI）抗性評價DI=0免疫Immune（I）0.0＜DI≤5.0高抗Highlyresistant（HR）5.0＜DI≤10.0抗病Resistant（R）10.0＜DI≤20.0中抗Moderatelyresistant（MR）20.0＜DI≤40.0中感Moderatelysusceptible（MS）40.0＜DI≤60.0感病Susceptible（S）60.0＜DI≤100.0高感Highlysusceptible（HS）抗病鑒定有效性判別當(dāng)設(shè)置的感病對照品種的病情指數(shù)（DI）在40~60之間，判定該次水稻對泛菌葉枯病抗性鑒定有效。重復(fù)鑒定抗性評價結(jié)果抗性評價結(jié)果記載采用附錄C的表C.2，并對試驗結(jié)果加以分析，原始資料應(yīng)保存完整備考察驗證。鑒定后材料的處理接種體處理剩余接種體帶回實驗室滅菌處理。接種后病株處理鑒定后的病株無害化處理。記錄2年。附 錄 A（規(guī)范性）菠蘿泛菌的生物學(xué)特性、水稻危害癥狀及分離鑒定和保存方法分類地位菠蘿泛菌（Pantoeaananatis）屬原核生物界（Procaryotae、細(xì)菌門（Bacteria、γ桿菌綱Gammaproeobaeranerobaceraesrwinaceaanoea，anoeaannas。生物學(xué)特性形態(tài)特征革蘭氏陰性桿菌，無莢膜，無芽孢，在NA、LB、PSA培養(yǎng)基上菌落呈黃色、圓形隆起且邊緣光滑，長1.0μm~3.0μm，寬0.5μm~1.0μm，周生鞭毛。生理生化特性兼性厭氧；過氧化氫酶、明膠和淀粉水解呈陽性反應(yīng)；氧化酶，精氨酸二水解酶，檸檬酸鹽利用、L-阿拉伯糖產(chǎn)酸。4℃~4128℃~30℃。pHpH2.0~pH8.0pH7.0。水稻泛菌葉枯病田間典型癥狀由菠蘿泛菌引起的水稻泛菌葉枯病主要危害水稻葉片，在水稻分蘗末期-孕穗期開始顯癥，病害初期葉片頂端開始出現(xiàn)水漬狀病斑，后沿著葉緣的一邊或兩邊向下延伸，病斑由黃褐色逐漸變?yōu)樯詈稚７蛛x、鑒定和保存分離2cm~375%1min、1%3min~5min1mL滅菌的蒸餾水，PSA48h~72h，挑取單菌落純化培養(yǎng)。鑒定以上述獲得的分離物單菌落為模板，PCR特異性擴(kuò)增16SrRNA、gyrB（DNAgyrasesubunitB）、leuS（leucine-tRNAsynthetase）和rpoB（RNApolymerasebetasubunit），通過獲得的擴(kuò)增片段與與菠蘿泛菌標(biāo)準(zhǔn)株系LMG2665T（GenBankassemblyaccession:GCA_000710035.2）序列同源性（≥95%）來確定為同一種屬。其鑒定為菠蘿泛菌（Pantoeaananatis）的分離物經(jīng)柯赫氏法則（Koch’spostulates）驗證為水稻泛菌葉枯病病原菌后保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)的引物：見表A.1。R20μ2×KODX緩沖液10μ10M0.5KODXDNA聚0.5μLddH2O8.5μL。PCR5153030s~60個循環(huán)；最后，687min，4℃保存。PCR1%1539bp、1256bp、793bp944bp。PCR產(chǎn)物的序列比對：擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，直接Sanger測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫（/）中進(jìn)行BLAST分析，明確菌株的分類地位。保存挑取分離鑒定的菠蘿泛菌單菌落在M210液體培養(yǎng)基中28℃、200rpm震蕩培養(yǎng)16h~24h，加甘油（終濃度為25%）后，-80℃下貯存；或?qū)⒋朔蛛x純化的菌液100μL涂布PSA培養(yǎng)基平板，放置恒溫培養(yǎng)箱中28℃黑暗培養(yǎng)24h~48h后，轉(zhuǎn)至4℃冰箱保存。表A.1菠蘿泛菌分離株鑒定所用引物序列目標(biāo)基因引物名稱引物序列（5’-3’）16SrRNA27FAGAGTTTGATCATGGCTCAG1492RAAGGAGGTGATCCAGCCGCgyrBgyrBFGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGAgyrBRGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCATleuSleuSFCAGTGGTTTATCAAAATCACCleuSRGGATAACCGGAAGCTGATCTTrpoBrpoBFGGCTGAAAACCAGTTCCGCGTrpoBRCCAGAGAGACACACGGCATCT附 錄 B（規(guī)范性）水稻對泛菌葉枯病抗性鑒定對照品種水稻對泛菌葉枯病抗性鑒定采用的對照品種見表B.1。表B.1水稻對泛菌葉枯病抗性鑒定對照品種序號品種名稱品種類型抗性類型1武運粳7號粳型常規(guī)稻免疫2紹糯9714粳型常規(guī)稻高抗3黃華占秈型常規(guī)稻抗病4輻恢838秈型常規(guī)稻感病5明恢63秈型常規(guī)稻感病附 錄 C（資料性）水稻對泛菌葉枯病抗性鑒定結(jié)果記錄表式水稻對泛菌葉枯病抗性鑒定原始數(shù)據(jù)記錄表和抗性鑒定評價結(jié)果匯總表分別見表C.1和表C.2。表C.1水稻對泛菌葉枯病抗性鑒定原始數(shù)據(jù)記錄表品種名稱重復(fù)區(qū)號病斑長度/接種葉片總長123456789101112IⅡⅢIⅡⅢ