高效液相色譜儀的使用方法及應(yīng)用

高效液相色譜儀的使用方法及應(yīng)用高效液相色譜儀的使用方法1、開機設(shè)定參數(shù)（檢測波長、流速），更換所需流動相，檢查色譜柱是否正確。2、排液置換管路中流動相，沖洗進(jìn)樣閥，洗好進(jìn)樣針。3、沖洗色譜柱進(jìn)行平衡，其間可提前進(jìn)行樣品的處理，樣品信息的注冊。4、平衡好以后進(jìn)空白試驗，排除系統(tǒng)污染。5、柱子穩(wěn)定好以后進(jìn)樣，等待運行結(jié)束（其間清洗進(jìn)樣針），積分計算，出具報告。詳細(xì)操作步驟如下：1、開機操作：（1）、打開電源，用Harb相連接時，注意Harb電源，打開計算機，打開BootpServer（一般啟動時已打開）；（2）、自上而下打開個組件電源，BootpServer里顯示有信號時（有六行字符），打開工作站（先打開Online）；（3）、打開沖洗泵頭的10％異丙醇溶液的開關(guān)（需用針捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量為準(zhǔn)；（4）、注意各流動相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于最低限會自動停泵，注意洗泵溶液的體積，及時加液；（5）、使用過程中要經(jīng)常觀察儀器工作狀態(tài)，及時正確處理各種突發(fā)事件。2、先以所用流動相沖洗系統(tǒng)一定時間（如所用流動相為含鹽流動相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動相），正式進(jìn)樣分析前30min左右開啟D燈或W燈，以延長燈的使用壽命；3、建立色譜操作方法，注意保存為自己命名的Method，勿覆蓋或刪除他人的方法及實驗結(jié)果；4、使用手動進(jìn)樣器進(jìn)樣時，在進(jìn)樣前和進(jìn)樣后都需用洗針液洗凈進(jìn)樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進(jìn)樣前必須用樣品液清洗進(jìn)樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡；5、溶劑瓶中的沙芯過濾頭容易破碎，在更換流動相時注意保護(hù)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過濾頭變臟或長菌時，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；6、實驗結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過程中關(guān)閉D燈、W燈；7、關(guān)機時，先關(guān)閉泵、檢測器等，再關(guān)閉工作站，然后關(guān)機，最后自下而上關(guān)閉色譜儀各組件，關(guān)閉洗泵溶液的開關(guān)；8、使用者須認(rèn)真履行儀器使用登記制度，不要擅自拆卸儀器。流動相：1、流動相應(yīng)選用色譜純試劑、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過濾后使用，過濾時注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍；2、水相流動相需經(jīng)常更換（一般不超過2天），防止長菌變質(zhì)；3、使用雙泵時，A、B、C、D四相中，若所用流動相中有含鹽流動相，則A、D（進(jìn)液口位于混合器下方）放置含鹽流動相，B、C（進(jìn)液口位于混合器上方）放置不含鹽流動相；A、B、C、D四個儲液器中其中一個為棕色瓶，用于存放水相流動相。樣品：1、采用過濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒；2、用流動相或比流動相弱（若為反相柱，則極性比流動相大；若為正相柱，則極性比流動相小）的溶劑制備樣品溶液，盡量用流動相制備樣品液；手動進(jìn)樣時，進(jìn)樣量盡量小，使用定量管定量時，進(jìn)樣體積應(yīng)為定量管的3～5倍；色譜柱：1、使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說明書，注意適用范圍，如pH值范圍、流動相類型等；2、使用符合要求的流動相；3、使用保護(hù)柱；4、如所用流動相為含鹽流動相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。5、色譜柱在不使用時，應(yīng)用甲醇沖洗，取下后緊密封閉兩端保存；6、不要高壓沖洗柱子；7、不要在高溫下長時間使用硅膠鍵合相色譜柱；高效液相色譜儀的特點高壓——壓力可達(dá)150～300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。高速——流速為0.1～10.0mL/min。高效——塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時分離成份可達(dá)100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：速度快——通常分析一個樣品在15～30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高——可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高——紫外檢測器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。色譜柱可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。高效液相色譜儀的應(yīng)用高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合，HPLC所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時測定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個