北京質(zhì)譜中心質(zhì)譜講座

北京質(zhì)譜中心有機質(zhì)譜講座

熊少祥中國科學(xué)院化學(xué)研究所北京質(zhì)譜中心離子源質(zhì)量分析器數(shù)據(jù)系統(tǒng)離子檢測器真空系統(tǒng)進樣系統(tǒng)電子電離

EI化學(xué)電離

CI場解吸

FD(FI)快原子轟擊

FAB(LSIMS)熱噴霧

TS粒子束

BP電噴霧

ESI大氣壓化學(xué)電離

APCI基質(zhì)輔助激光解吸電離

MALDI渦輪泵(或擴散泵)10-3Pa旋轉(zhuǎn)泵10-1Pa有機質(zhì)譜儀的構(gòu)成

倍增器

SEM微通道板

MCPGCLC直接進樣探頭四極桿Quadrupole四極離子阱IT

扇形場

Sector飛行時間管TOF-MS離子回旋共振池ICR-MS離子極性非極性分子量(Da)EI或CIESI或MALDIAPCIThermosprayPB各種離子化方法的使用范圍選擇的依據(jù)揮發(fā)性熱穩(wěn)定性極性要求取得的結(jié)構(gòu)信息

同位素峰m/z128分子中

10個碳全部都是12Cm/z129分子中有

1

個碳是13Cm/z130分子中有

2

個碳是13C相對豐度m/z豐度1269.212719.2128100.012910.81300.8

100127I97.381Br10079Br32.037Cl10035Cl4.534S0.8033S10032S10031P3.430Si5.129Si10028Si10019F0.2018O0.0417O10016O0.3715N10014N1.113C10012C0.0122H1001H豐度

%元素豐度

%元素豐度

%元素A+2A+1A有機質(zhì)譜中常見同位素的天然豐度*O,Si,S,Cl,Br

可稱為

A+2

元素

12CH3

O

12CH2

12CH3(全為12C)

m/z60(100%)A

13CH3

O

12CH2

12CH3(含一個13C)

m/z61(1.1%)A+1

12CH3

O

13CH2

12CH3(含一個13C)

m/z61(1.1%)A+1

12CH3

O

12CH2

13CH3(含一個13C)

m/z61(1.1%)A+1

17O對(A+1)峰的貢獻僅為0.04%，可以忽略因此m/z61的相對豐度應(yīng)為：

(1.1+1.1+1.1)%=3(1.1)%=3.3%。同位素峰的豐度概率與同位素峰豐度假如一個分子中有3個碳:C1，C2，C3

設(shè):12C

豐度=a，13C

豐度=

b則出現(xiàn)12C1,12C2,12C3的概率=a3A峰豐度=a3

13C1,

12C2,12C3

的概率

=a2b

A+1

峰

12C1,

13C2,

12C3

的概率

=a2b

A+1峰豐度=3a2b

12C1,12C2,

13C3

的概率=a2b

A+1峰

13C1,

13C2,

12C3

的概率=ab2

A+2峰

13C1,

12C2,

13C3

的概率=ab2

A+2峰豐度=3ab2

12C1,

13C2,

13C3

的概率=ab2

A+2峰

13C1,13C2,13C3

的概率=b3

A+3峰豐度=

b3二項式

(a+b)3=a3+3a2b+3ab2+b3

的展開式中各項與上述A，A+1，A+2，A+3峰的出現(xiàn)概率相符合，十分便于記憶。1.19

按二項式的展開式計算某同位素峰的豐度：(a+b)n=an+nan-1b+n(n-1)an-2b2/2!+n(n-1)(n-2)an-3b3/3!+…..+bn

a

為輕同位素的豐度

b

為重同位素的豐度

n

為分子式中該元素的原子數(shù)目

只含輕同位素峰的豐度，

A=an

含一個重同位素峰的豐度，A+1=nan-1b

含兩個重同位素峰的豐度，A+2=n(n-1)an-2b2/2!

含三個重同位素峰的豐度，A+3=n(n-1)(n-2)an-3b3/3!

………….

含n個重同位素峰的豐度，A+n=bn

計算同位素峰豐度計算同位素峰豐度的例子(含有多個鹵素)

13C37Cl總和A+1(181)6(1.1)=6.66.6(181)A+2(182)6(5)(1.1)2/2/100=0.183(32.5)=97.597.7(182)A+3(183)6.4(m/z182的13C

峰對m/z183的貢獻)6.4(183)A+4(184)

3(32.5)2/100=31.731.7(184)相對豐度氯和溴組合的天然同位素豐度的分布模式00ClBr432112543100.97.351.4100.48.634.3100.97.3

31.517.668.5100.64.815.8100.1.9677.4100.24.144.2100.69.213.426.585.8100.48.57.814.460.8100.

79.429.94.110063.910.262.0100.44.96.238.7100.88.731.13.720.874.0100.

63.118.32.012.154.8100.

93.246.311.5100.95.930.63.351.8100.64.217.11.632.193.1100.

49.311.31.09.746.893.8100.60.821.03.816.865.2100.76.931.16.30.578.2100.47.910.20.844.4

100.82.532.36.60.424.779.7100.62.620.93.60.213.958.4100.90.146.113.42.10.17.438.483.7

100.71.431.18.11.262.6100.63.920.43.30.238.899.8100.51.214.42.10.119.769.8100.75.432.68.21.10.111.451.597.2100.61.323.15.20.75.732.275.7100.81.542.514.23.0

0.4同位素峰豐度的應(yīng)用實例（反映合成情況）燈絲過流保護電路燈絲電流調(diào)控管燈絲供電電源樣品電子加速電壓加熱器及溫度控制磁鐵電離室離子引出及聚焦透鏡磁鐵燈絲比較器電子收集極質(zhì)量分析器EI離子源電子加速電壓:50～100V電離室壓力:10-2

～10-3Pa生成離子的內(nèi)能:1～20eV

優(yōu)勢：已發(fā)展了半個多世紀積累了大約20萬張質(zhì)譜圖是快速鑒定混合物組分的手段局限性：要求樣品能氣化

(樣品蒸氣壓

>10-2Pa)往往無分子峰(降低電子動能無助于獲得分子峰)負離子

EI靈敏度極低GC/MS的應(yīng)用特點

快速鑒定有機混合物的組分(高通量)

對GC分離的要求較低(重疊峰的分解)

定量分析的高可靠性(特征離子質(zhì)量色譜圖)m/zm/z3,3-二乙氧基-1-甲基-4-苯基-氮雜環(huán)丁烷-2-酮分別在70V和15V電子加速電壓下得到的兩張質(zhì)譜圖電子動能對EI質(zhì)譜圖的影響燈絲過流保護電路燈絲電流調(diào)控管燈絲供電電源樣品電子加速電壓加熱器及溫度控制磁鐵電離室離子引出及聚焦透鏡磁鐵燈絲質(zhì)量分析器推斥極電子總發(fā)射電流反應(yīng)試劑CI

離子源工作原理：

離子(反應(yīng)試劑)/分子反應(yīng)電離室壓力：

～50Pa(0.5Torr)

平均自由程～0.1mm

充分發(fā)生碰撞電離室通道的孔徑：

50～100

m甲烷

I35/I18=0.05

異丁烷

I57/I43=1

氨I35/I18=0.05注意：掃描起始點必須高于反應(yīng)離子質(zhì)量數(shù)25MPa0.16MPa反應(yīng)氣甲烷作為反應(yīng)試劑CH4CH4CH3++?

HCH4+CH4CH5+(反應(yīng)離子)+?

CH3(質(zhì)子轉(zhuǎn)移)

CH4+CH3+C2H5+(反應(yīng)離子)+H2+·-e+·m/z16m/z15m/z17m/z29CH4質(zhì)子親合能(ProtonAffinity)

PA543kJ/mol甘油

(Glycerol)

PA874.8kJ/mol

差值：

(874.8-543)kJ/mol=

331.8kJ/mol3.4eV

(內(nèi)能)M+CH5+[M+H]++CH4

[M

····H+-CH4

M-H+

····CH4]

M+C2H5+[M-C2H5+](加合離子)m/z=M+1m/z=M+29M+C4H9+

[M+H]++C4H8

[M

····H+-C4H8

M-H+····CH4]M

+C4H9+[M-C4H9+](加合離子)m/z=M+57m/z=M+1異丁烷作為反應(yīng)試劑m/z58iso-C4H10C4H10C3H7++·CH3iso-C4H10+C3H7+C4H9+(反應(yīng)離子)+C3H8(氫負離子轉(zhuǎn)移)+·m/z43m/z57iso-C4H8

質(zhì)子親合能

(ProtonAffinity)

PA802.1kJ/mol甘油(Glycerol)

PA874.8kJ/mol

差值：

(874.8-802.1)kJ/mol=

72.7kJ/mol0.75eV(內(nèi)能)鄰苯二甲酸二辛酯的EI

和CI

質(zhì)譜圖深海魚油(甲酯化)GC/EI-MS及GC/CI-MS分析CI

反應(yīng)類型(2)

負離子

CI反應(yīng)類型

(a)protonabstraction[M-1]-

ABH+X-

AB-+HX

(b)chargetransferM-

AB+X-

AB-+X

(c)attachment

AB+X-

ABX--

(d)resonancecapture

AB+eAB-

(e)ionpairproduction

AB+eA++B-+e

(f)dissociativeresonancecapture

AB+eA-+B?(1)

正離子

CI

反應(yīng)類型

(a)

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)

[M+1]+

(b)氫負離子轉(zhuǎn)移反應(yīng)

[M-1]+

(c)

形成加合離子

(d)

電荷交換反應(yīng)

M+

(e)

其它反應(yīng)一般：

含雜原子化合物出現(xiàn)[M+1]+

含多個稠環(huán)化合物出現(xiàn)M+含氨基化合物-用正離子

CI

有利有機酸、醇或含鹵素化合物-

用負離子

CI

有利發(fā)展趨勢：不僅為了獲取分子量信息，可用于確定官能團及其位，空間異構(gòu)體脂肪醇的負

CI

質(zhì)譜圖羧酸的負

CI

質(zhì)譜圖(氯仿溶劑引起

[M+Cl]-

)MW256MW284[M+Cl]

-MW256[M+Cl]

-EI注意：不是所有含鹵素化合物都能用

NCI得到準分子離子峰NCI異丁烷反應(yīng)氣含電負性基團化合物的負

CI

質(zhì)譜圖NCI異丁烷反應(yīng)氣快原子轟擊Fast

Atom

Bombardment(FAB)FABgun高分辨質(zhì)譜的優(yōu)點八肽的

FAB

質(zhì)譜圖粒子束

(ParticalBeam)改變推拆極電壓熱噴霧

(Thermospray)推拆極電噴霧電離

(Electro-sprayIonnizationESI)原理離子化過程

(三步)(1)

樣品溶液

噴霧(帶電)(2)霧滴分裂(3)

溶液中離子轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嚯x子納升噴霧(NanoSpray)

工作原理(純粹的電噴霧)距離

(d)(~3mm)高壓電源

(VC)(~3kV)質(zhì)量分析器毛細管，半徑

rC(~50m)霧滴氣相離子錐孔電子1.噴霧2.液滴分裂3.生成氣相離子發(fā)生穩(wěn)定噴霧的條件

（1）要有足夠強的電場（噴霧、電荷分離）（2）流體要有一定的線速度（3）流體要含有一定量的電介質(zhì)（離子）距離

(d)(~3mm)高壓電源

(VC)(~3kV)質(zhì)量分析器毛細管，內(nèi)徑

rC(~50m)霧滴氣相離子錐孔電子溶劑：

水、甲醇、乙氰、各種比例混合液(常用)

乙醇、異丙醇、丁醇、二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇混合液

四氫呋喃、丙酮、DMSO*、DMF*(*沸點較高)

甲苯(用于富勒烯)水的純度：

電導(dǎo)率

18M/cm3

(多肽、蛋白質(zhì)、PMF分析，不希望有鈉、鉀加合離子)緩沖試劑：(含量0.5~1%)

甲酸、乙酸、乙酸銨、氫氧化銨、甲銨、三乙銨

鈉鹽、鉀鹽(10～15

M)

三氟乙酸(TFA)的抑制作用

三氟乙酸陰離子與樣品形成離子對，導(dǎo)致中性化。

0.1%TFA會使樣品信號下降至1/5~1/10克服方法

鞘流：20～50%

丙酸的異丙醇溶液雜質(zhì)干擾：

鄰苯二甲酸二辛酯m/z391[M+H]+

m/z413[M+Na]+

蛋白質(zhì)常含硫酸鹽、磷酸鹽會出現(xiàn)[M+1+98]+

十二烷基磺酸鈉(SDS)、TritonX

會完全掩蓋蛋白質(zhì)信號

NanoSprayInterfaceLCflowlineSheathflowlinePEEKferruleID180

mStainlessSteelLiner2~3mmID25μmFusedSilicaCapillary電路必須與溶液連通1.尖嘴毛細管2.毛細管加金屬外套

(樣品稀釋)3.分段毛細管

(死體積)4～5cm

id

5～50

m

od

1～2mm導(dǎo)電涂層On-lineSeparationandDetectionofPeptidesbyCapillaryElectrophoresis/CapillaryESI-FTMS（1）AngiotensinIII(2)Octreotide(3)ElastinChemotacticAPI

離子源用錐孔隔開大氣壓和真空室新結(jié)構(gòu)：垂直噴霧Z噴霧ESIAPCIIn-sourceCIDfragmentation(clenbuterol)可獲得結(jié)構(gòu)信息

特點

1

用毛細管隔開大氣壓和真空室194.9397.1609.3ESI

的發(fā)展趨勢

-nanospray還原譜ESI多電荷譜M為分子量15416.3(M)蛋白的

ESI質(zhì)譜圖(多電荷離子)

(13+)(12+)多電荷離子降低了m/z,用四極桿，離子井質(zhì)譜儀可測定大分子需要通過解聯(lián)立方程才能由低分辨質(zhì)譜圖解得分子量和電荷數(shù)高分辨ESI譜圖高分辨離子回旋共振質(zhì)譜儀(ICRMS)能把多電荷離子的同位素峰分開，從而容易確定各個峰的電荷數(shù)4.7TeslaubiquitinHumanGrowthHormon(intact):FTMSSpectrum051015202530354045505560657075808590951001250130013501400145015001550160016501700m/z1476.03691383.78321302.44101581.25241230.24821703.0424RelativeAbundance+18+17+16+15+14+137.0Tesla解電荷數(shù)計算分子量高分辨

ESI電荷數(shù)

=同位素峰間質(zhì)量差1=50.21=290.0341Isotopepeaksarespacedby1Da,sothechargeis1VasopressinIsotopepeaksarespacedby0.2Da,sothechargeis5BovineinsulinIsotopepeaksarespacedby0.034Da,sothechargeis29Carbonicanhydrase多電荷離子在

ESI

源內(nèi)

CID若這是低分辨質(zhì)譜圖則很難得到其還原譜圖只有高分辨質(zhì)譜圖才有可能作這種還原非共價鍵相互作用分子間或集團間弱的相互作用，包括：(1)靜電作用(2)氫鍵作用(3)范德華力作用(4)疏水作用(5)陽離子-

鍵相互作用用

ESI

(軟電離技術(shù))可研究非共價鍵相互作用ESI是目前最溫和(Soft)的離子化技術(shù)用ESI

研究非共價鍵相互作用血管緊張肽反意肽用ESI

研究非共價鍵相互作用=

=

雞蛋白溶菌酶Anal.Chem.2004,76,211基質(zhì)輔助激光解吸電離MatrixAssistedLaserDesorptionIonisation,MALDI胰島素的MALDI-TOF質(zhì)譜圖分辨率

=12000MeasurementMode:ReflectronMSSample:BovineInsulinMatrix:Sinapinicacid反射方式分辨率0102030405060708090100%Int.57245726572857305732573457365738574057425744Mass/Charge7[c].K85733.59925734.60065732.61165731.61925735.62035736.63335730.6500Resolution=22,000指標：Rs=20,000胰島素AXIMA-CFRplusSHIMADZUBIOTECH牛血清白蛋白

(BSA)的

MALDI-TOF質(zhì)譜圖BSA-DimerSAasmatrixMALDI-TOF能分析的大分子樣品是

BSA的二聚體,(MH+)=13,2731，還可觀察到兩個二聚體的締合物，質(zhì)量數(shù)高達

26,4725

肽質(zhì)量指紋譜PeptideMassFigerprinting,PMF人肺癌細胞中蛋白的二維凝膠電泳分離2D-3

點上蛋白的PMF譜圖上

?

表示其質(zhì)量數(shù)與庫中某蛋白的肽段相符2???????????2D-2

號蛋白檢索結(jié)果MALDI的應(yīng)用蛋白和多肽

(PeptidesandProteins)寡聚核苷酸

(Oligonucleotides)碳水化合物

(Carbohydrate)合成高分子聚合物

(Syntheticpolymers)類脂類

(Lipids)天然產(chǎn)物

(Naturalproducts)

(生物堿、甙類、甾類等)

合成有機物Polymers(e.g.PEG4000-Li)RO

(-CH2-CH2-O-)