T-SDYYXH 02-2023 基于斑馬魚模型的藥物早期腎臟毒性快速評價方法

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C10SDYYXH T/SDYYXH

基于斑馬魚模型的藥物早期腎臟毒性快速評價方法A

rapid

method

for

evaluating

early

of

drugs

using

zebrafish

model 山東省醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會??發(fā)

布學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載

022023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載

II

10

11

12

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022023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載 本文件按照

1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定II學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載

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準(zhǔn)備、試驗步驟、保證試驗有效性的條件、判定步驟、數(shù)據(jù)處理與試驗報告等內(nèi)容。本文件適用于基于斑馬魚模型的藥物早期腎臟毒性評價。

本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

39649

實驗動物

實驗與質(zhì)量控制GB/T

21808

化學(xué)品

魚類延長毒性14天試驗GB

5749

生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1

綱、鯉形目、鯉科、斑馬魚屬、斑馬魚種。3.2AB

AB

strain

實驗室常用斑馬魚品系，由單倍體細(xì)胞經(jīng)早期加壓法獲得。3.3

性腺發(fā)育尚未成熟的斑馬魚。3.4

斑馬魚胚胎體外受精后的小時數(shù)。3.5

periocular

斑馬魚雙眼內(nèi)部由于水分分布失衡，液體局部堆積使眼外圍輪廓異常膨大。3.6

creatinine3.7

proteinuria尿液中的蛋白質(zhì)含量增加而能夠被檢測到，反映腎臟濾過屏障功能情況。3.810

10%

lethal

受試物導(dǎo)致10%受試魚死亡的濃度。15秒內(nèi)沒有心跳判定為死亡。3.9

quantitative

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斑馬魚胚胎發(fā)育周期短，72hpf腎發(fā)育完成。在進化水平上，斑馬魚幼魚的腎為前腎，僅由一nephrin基因表達量和kim1基因表達量等指標(biāo)，可以評價樣品的腎毒性。

5.1

非水溶性樣品：選用有機溶劑、乳化劑或分散劑等進行助溶，制備成均勻分散的懸濁液或乳濁5.2

10mg～50

30mL～505.3

a)

b)

c)

6.1

6.2

0.5

mL6.3

40

6.4

℃；溫控范圍：0

℃～99.9

℃。6.5

℃。6.6

6.7

6.8

試驗容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受試物可能吸附于聚苯乙烯容器時，應(yīng)選用惰性材料（如玻6.9

6.106.11

0.5

～50

mL。6.12

96

7.1

發(fā)育至72

hpf健康A(chǔ)B系斑馬魚仔魚。斑馬魚的應(yīng)用符合GB/T

39649相關(guān)規(guī)定。學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載

022023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載7.2

24

GB

5749

mmol/L

0.17

mmol/L

mmol/L

CaCl

0.16

mmol/L

MgSO

14.625

MgSO

000

mL

50

20

mL

50

980

mL

pHCaCO計）為10

mg/L～250

6.0

7.3

pH

6.5～8.0

pH

如果加入受試物后試驗溶液的

pH

值小于

6.5

或大于

8.0，按照

GB/T

的相關(guān)規(guī)

pH

非水溶性受試物，添加有機溶劑、乳化劑或分散劑提高受試物溶解度和試驗溶液的均勻度。受

100

8.1

試驗設(shè)置空白對照組、陽性對照組和受試物組，如使用助溶劑，增設(shè)1個溶劑對照組。8.2

mL斑馬魚培養(yǎng)水，6孔板中每孔含50尾仔魚和5

8.3

mL助溶劑溶液，6孔板中每孔含50尾仔魚和5

mL助溶劑溶液。助溶劑溶液濃度為受試物組使用助溶劑的最高濃度。8.4

馬兜鈴酸a用助溶劑二甲基亞砜配制成2

mM儲液，使用時用培養(yǎng)水稀釋至所需濃度。隨機挑取

μM馬兜

mL濃度為5

μ8.5

mL受

mL受試物溶液。試驗時根據(jù)需要設(shè)置多個受試物濃度組。8.6

℃的恒溫光照培養(yǎng)箱，避光連續(xù)暴露24

h。8.7

暴露結(jié)束，將仔魚放置載玻片，調(diào)至俯臥位，顯微鏡下觀察仔魚眼部形態(tài)，采集圖像。8.8

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022023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載暴露結(jié)束后，收集仔魚，加入適量體積0.9%

NaCl溶液，冰浴下充分勻漿。離心后取上清，過柱去蛋白，按試劑盒步驟檢測每組樣品中肌酐含量。8.9

暴露結(jié)束后，移走仔魚，收集各組處理溶液，離心后取上清，放入層析袋內(nèi)，濃縮樣品溶液。各組樣品中的蛋白條帶。8.10

9.1

90

9.2

水溶性受試物可配制成澄清溶液，非水溶性受試物可選用二甲基亞砜、乙醇、丙酮等有機溶劑進9.3

10

10.1 10.2 10.3受試物組與空白對照組相比，斑馬魚組織肌酐水平在統(tǒng)計學(xué)上顯著增加（P＜0.05），此時試驗10.4 受試物組與空白對照組相比，斑馬魚腎病蛋白基因（nphs1）和腎損傷分子基因（havcr1）的表達量在統(tǒng)計學(xué)上顯著增加（P＜0.05），此時試驗結(jié)果可作為受試物具有腎毒性的支持證據(jù)，但不替代11

11.1

11.2

T-test

12

試驗報告包含下列內(nèi)容：a)

b)

c)

1)

2)

3)

4)

斑馬魚培養(yǎng)水特性：pH

5)

試驗容器內(nèi)的水質(zhì)：pH

6)

d)

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