0毛煜-毒代動力學在新藥臨床前安全性評價中的應(yīng)用

13三月20240毛煜毒代動力學在新藥臨床前安全性評價中的應(yīng)用Non-clinicalsafetyevaluation急性毒性試驗(acutetoxicity)長期毒性試驗(chronictoxicity)特殊毒性試驗(genotoxicity、reproductive、carcinogenicity)其他毒性(Allergic、stimulate、hemolysis)TGN1412試藥人注射新藥后出現(xiàn)嚴重過敏反應(yīng)Extrapolation？SpeciesdifferentinADMEattoxicitydoseAbsorptionDistributionMetabolismExcretiontoxicokineticsDoseToxicity一、什么是毒代動力學？（概述）二、毒代動力學的試驗設(shè)計三、伴隨毒性試驗的不同領(lǐng)域的毒代動力學四、TK研究的具體實例

毒代動力學

一、什么是毒代動力學？（概述）

伴隨（concomitant）毒代動力學Toxicokinetics=Toxikon+kinesis毒代動力學（Toxicokinetics）的定義毒代動力學是藥代動力學在全身暴露評價中的延伸，為非臨床毒性研究的一個組成部分，或為某一特殊設(shè)計的補充研究。研究結(jié)果可用于闡明毒理學發(fā)現(xiàn)及其與臨床安全性的關(guān)系。ICHTopicS3―Toxicokinetics:AGuidanceforAssessingSystemicExposureinToxicologyStudies有關(guān)毒代動力學的指導(dǎo)性文件InternationalConferenceonHarmonisationofTechnicalRequirementsforRegistrationofPharmaceuticalsforHumanUse我國SFDA（國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心）有關(guān)毒代動力學的指導(dǎo)性文件研究目的描述在動物上造成的全身暴露；暴露水平與毒理學結(jié)果之間的關(guān)系；支持動物種屬、給藥方案的選擇；評價動物結(jié)果與臨床安全性的相關(guān)性藥物系統(tǒng)循環(huán)中的藥物濃度吸收藥物在組織中的分布作用部位的藥物濃度藥物的代謝或排泄分布消除藥理活性臨床療效藥效毒性藥物代謝動力學的研究Pharmacokinetics~Toxicokinetics

Differentgoals

PK-ADMEproperties

TK-safetyassessment

Differentdose藥物溶解性：由于毒代動力學研究時采用的高給藥劑量所導(dǎo)致的給藥問題，更嚴重的情況：動物體液或組織器官產(chǎn)生藥物沉淀所導(dǎo)致的特殊毒性。藥物穩(wěn)定性：高劑量所導(dǎo)致的藥物穩(wěn)定性的改變以及可能的降解等問題。藥物吸收：藥物吸收在毒代動力學研究中的高劑量給藥下可能出現(xiàn)藥物在胃腸道的溶解度下降而影響藥物的吸收。首過效應(yīng)或系統(tǒng)前清除：機體的系統(tǒng)前清除是酶依賴性的過程，因此，在高劑量下會出現(xiàn)飽和。技術(shù)層面上的問題：4.血漿蛋白結(jié)合率：藥物與血漿蛋白的結(jié)合是可逆的，且有飽和性，因此，在毒性劑量下，藥物的分布和組織通透性會受到影響，產(chǎn)生不同于藥代劑量下的血漿濃度-藥效相關(guān)性的情況。代謝：由于代謝是依賴酶的反應(yīng)，它與底物的濃度相關(guān)。因此，在毒性劑量下，藥物的體內(nèi)代謝途徑和代謝活性可能發(fā)生改變。腎清除：腎清除既有飽和又有非飽和的作用機制的參與，且受循環(huán)藥物濃度的影響大，毒性劑量可能影響腎臟清除藥物的能力，特別是僅從腎臟排泄，且有主動排泄機制的藥物。TK須遵循GLP原則在開展毒代動力學研究時應(yīng)遵循以下原則：遵照GLP的要求開展毒代動力學研究所用的分析方法可靠實驗設(shè)計合理應(yīng)結(jié)合毒理學和藥動學研究結(jié)果對毒代動力學研究結(jié)果進行綜合分析和評價，同時應(yīng)注意具體問題具體分析毒代動力學研究規(guī)范★實驗要求在GLP規(guī)范下進行受試物給藥樣品樣品處理LC-MS/MS分析二、毒代動力學的試驗設(shè)計要點

1.分析方法★藥物濃度測定方法的技術(shù)要求與藥代動力學研究相同(專屬性好靈敏度高)MethodvalidationRobustandreliablemethodReproducibilityAccuracySpecificitySensitivitySpecificitySensitivityAccuracySpecificitySensitivityReproducibilityAccuracySensitivityReproducibilityAccuracySpecificitySensitivityReproducibilityAccuracy氣相色譜法（不常用，用于揮發(fā)性好、耐熱的化合物檢測）高效液相色譜法（連接紫外或熒光檢測器，具有經(jīng)濟、簡單的特點，但專屬性較差）液相-單級質(zhì)譜聯(lián)用檢測液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測（靈敏度高，特異性好，能同時獲得可靠的定性定量結(jié)果）毛細管電泳法（適用于蛋白質(zhì)等的定量分析）毒代生物樣品的分析方法毒代動力學與藥代動力學一樣，要求建立靈敏度高、特異性好的血藥濃度測定方法，測定方法的建立和確證應(yīng)按照藥代動力學有關(guān)技術(shù)要求進行。方法學驗證穩(wěn)定性（stability）考察了解待測藥物和內(nèi)標物在不同pH、光照、溶劑、溫度條件下穩(wěn)定性。生物樣品中藥物的穩(wěn)定性包括室溫、冷藏（2～8℃）、凍融、冷凍（-20～-70℃）、進樣盤中放置的考察，可參考藥代動力學的實驗結(jié)果。靈敏度：最低定量下限（LLOQ）

應(yīng)滿足日內(nèi)準確度和精密度<20%。根據(jù)藥物體內(nèi)藥物濃度確定,一般為3～5個半衰期或峰濃度的1/10～1/20。生物樣品基質(zhì)干擾（matrixeffect）的考察

應(yīng)考察生物樣品基質(zhì)對待測物檢測的干擾程度。如全血、血漿或血清等常用生物樣品的內(nèi)源性干擾。選擇性（selectivity）的考察內(nèi)源性物質(zhì)、藥物的代謝物、可能的合并用藥及中藥中其他組分不干擾分析。提供對照品、空白生物樣品、空白生物樣品加對照品及用藥后的生物樣品色譜圖。A空白血漿樣品B空白血漿樣品中加入內(nèi)標化合物C空白血漿樣品中添加標準品D毒代血漿樣品標準曲線（standardcurve）及線性關(guān)系

應(yīng)分別制備藥物在不同生物樣品（如血漿、全血、尿、組織勻漿）中的標準曲線。每條標準曲線一般需6～7個濃度點，每個濃度點2～3個平行樣。線性范圍應(yīng)覆蓋整個生物樣品的濃度范圍，濃度超過最高檢測上限（ULOQ）的樣品應(yīng)進行適當?shù)南♂?。標準曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。y=0.0076+0.0109X,r=0.9999,n=7(duplicateforeachpoint),weighingfactor:1/xLC-02concentrationinplasma,ng/mLPeakarearatio方法精密度與準確度

精密度包括日內(nèi)精密度和日間精密度，一般要求應(yīng)選取工作曲線低、中、高三個濃度進行考察，每個濃度需4～5個平行樣。日內(nèi)和日間的精密度應(yīng)滿足相對標準誤（relativestandarddeviation，RSD%）<15%,在LLOQ濃度點附近應(yīng)滿足RSD%<20%.準確度一般用相對回收率（recovery，%）表示，選取低、中、高三個濃度點進行考察，每個濃度需4～5個平行樣。日內(nèi)和日間的準確度應(yīng)滿足<15%,在LLOQ濃度點附近應(yīng)滿足<20%.樣品稀釋倍數(shù)（dilutionfactor）的準確度考察超出標準曲線濃度范圍的生物樣品須經(jīng)稀釋后重新進樣分析。樣品稀釋的倍數(shù)需經(jīng)過驗證后方能應(yīng)用。進樣殘留（carryover）的考察

在分析完標準曲線最高檢測上限（ULOQ）樣品后立即設(shè)定運行一個空白樣品來考察方法的進樣殘留。進樣殘留應(yīng)盡可能小。2、TK研究的參數(shù)藥時曲線下面積AUC(areaunderconcentration-timecurve)

－吸收程度，暴露Cmax（血藥達峰濃度）Tmax（達峰時間）

－吸收速度，暴露t1/2（血漿消除半衰期）吸收速度不同-毒性不同血藥濃度最小中毒濃度(MTL)最小有效濃度(MEL)時間其他參數(shù)F:BioavailabilityCss：Cl:Vd:

時間血藥濃度AUC非靜脈

AUC靜脈

毒代動力學研究的評價蓄積：化學物或/和代謝產(chǎn)物在體內(nèi)進行性增加。蓄積受給藥時間間隔和該化學物半衰期的影響。線性動力學（linearpharmacokinetics）：藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運和消除速率常數(shù)呈現(xiàn)為劑量或濃度非依賴性，表現(xiàn)為血藥濃度或血藥濃度-時間曲線下面積與劑量呈正比。非線性動力學（linearpharmacokinetics）：由于藥物代謝和腎排泄所涉及的酶和載體具有可飽和性，藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運和消除速率常數(shù)呈現(xiàn)為劑量或濃度依賴性，此時藥物的消除呈現(xiàn)非一級過程，藥物半衰期、清除率等不為常數(shù)，AUC、Cmax等不與劑量成正比變化。3、動物◎避免單獨的毒代研究◎動物種屬的選擇Casestudy-動物選擇不當56種屬代謝差異的考慮CompoundDM1M2(active)Enzyme1Enzyme2毒代動力學研究中藥物代謝產(chǎn)物的測定當藥物為前藥，體內(nèi)產(chǎn)生藥效的是其代謝產(chǎn)物。當藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成具有藥效或毒性的代謝產(chǎn)物。當藥物在體內(nèi)被廣泛代謝，在血漿或組織中只能通過測定其代謝產(chǎn)物來反映給藥后體內(nèi)的暴露水平。4、給藥劑量的設(shè)計低劑量：無毒性反應(yīng)劑量,應(yīng)超過藥效學劑量下的暴露量。中劑量：低劑量暴露的合適倍數(shù)和高劑量暴露的合適分數(shù)。高劑量：主要通過毒性反應(yīng)來判斷,如吸收飽和則不再增加劑量。Dose(毒性劑量)-Exposure(劑量暴露)關(guān)系Lackofdose-AUCproportionality-劑量設(shè)計Transporters對藥物ADME的影響uptakeexcretioneffluxexcretionreabsorptionabsorption肝腎胃腸道5、給藥方案★Antiviralagent:

3equallydividedose（tid）1dose（qd）1-monthstudyinmonkey三、伴隨毒性試驗的不同領(lǐng)域的毒代動力學主要毒性試驗內(nèi)容急性毒性試驗

長期毒性試驗遺傳毒性試驗生殖毒性試驗致癌試驗組織分布試驗不同領(lǐng)域毒代動力學（1）急性毒性試驗毒性研究早期進行由暴露速度和暴露程度預(yù)測毒性提供長期毒性實驗方案設(shè)計的依據(jù)劑型不同領(lǐng)域毒代動力學（2）長期毒性實驗動物選擇符合藥效要求多劑量設(shè)計毒性研究與毒代研究同步設(shè)計并實施第一天暴露量與最后一次暴露量的比較穩(wěn)態(tài)濃度與AUC長期給藥后AUC的變化-降低010203040AUC540200劑量（mg/kg）第1天010203040AUC540200劑量（mg/kg）第1天第30天長期給藥后AUC的變化-降低010203040AUC540200劑量（mg/kg）第1天第30天第90天InductionofCYPenzymeTransporters長期給藥后AUC的變化-降低長期給藥后AUC的變化-升高Longhalf-lifeInhibitionofCYPTransporter不同領(lǐng)域毒代動力學（3）組織分布實驗（ICH原則）單劑量分布實驗為臨床前藥物安全評價的基礎(chǔ)實驗多劑量分布實驗必要■器官組織蓄積■穩(wěn)態(tài)濃度高■靶器官毒性明顯或特異分布■開發(fā)靶向釋放藥物exampleBumetanide(高效利尿藥）20mg/kg(rat):ineffective

0.015mg/kg(human):producingdiuresis

3%ofdrugexcretedinurineforrat,66%inurineforhuman

不同領(lǐng)域毒代動力學（5）遺傳毒性的毒代研究遺傳毒性陰性的藥物測定組織濃度測定骨髓濃度測定血藥濃度不同領(lǐng)域毒代動力學（6）生殖毒性中的毒代研究注意動物在妊娠期和授乳期與正常動物的差異重點研究胚胎毒性和對子代的影響采集母體、胎子和新生子，測定濃度和暴露量不同領(lǐng)域毒代動力學（7）致癌實驗中的毒代研究用藥3個月的藥物必須進行致癌實驗（JAPAN）用藥6個月的藥物必須進行致癌實驗（USA，EEC，ICH）不同領(lǐng)域毒代動力學（9）生物技術(shù)藥物的毒代研究一般化學藥物的毒代研究程序不適用與生物技術(shù)藥物免疫的介入影響藥代和毒代過程動物選擇應(yīng)考慮免疫的介入放射性標記物對結(jié)果的誤導(dǎo)ExposureandDosageratiosRatDogReproductiveToxicologyNOAEL(mg/kg/day)100mg/kg/day50mg/kg/day30mg/kg/dayExposureratio(AUCanimals/AUChumans)*1.11.50.3Dosageratio*(mg/m2)4.16.81.2Dosageratio*(mg/kg)2012.57.5*Humandoseof200mg;AUC10.2g?h/mL劑量比值A(chǔ)UC比值MTD人/LD10小鼠MTD人/LD10小鼠

阿扎胞苷6.01.1阿霉素5.00.8安丫啶0.81.3塞替派0.41.0順鉑2.21.3氟達拉賓0.10.1雙氫阿扎胞苷0.20.3exampleAntipsoriaticagentTwoformulations:0.1%,1%cream10-foldmarginofsafety0.1%cream:141ngeq.hr/ml33%absorption1%cream:838ngeq.hr/ml19%absorption0.1%cream,5g/day四、TK的應(yīng)用實例種屬間異速增長尺度律

SpeciesAllometricScaling具體實例Almosttoogoodtobetruemouse-to-elephant曲線MaxKleiber(1932)."Bodysizeandmetabolism"].Hilgardia

6:315–351.1、TK支持臨床I期劑量選擇具體實例Anti-viralcompound：AZT5mg/kg/day:8~10%increaseofRBC,AUC:6μg.hr/ml→tox-endpointEquations:AUC(monkey)=F(m)×D(m)/CL(m)

AUC(human)=F(h)×D(h)/CL(h)AllometryapproachActualexposureinhuman

Dose(huamn)=5mg/kg×[0.3L/hr/kg/0.9L/hr/kg]=1.7mg/kg/day2.Sophocarpine（SC）的Beagle犬毒代動力學研究LC-MS/MS法定量分析SC（內(nèi)標法）具體實例LC-MS/MS色譜圖標準品空白犬血漿空白犬血漿添加標準品毒代血漿樣品血漿樣品前處理-不同提取溶劑提取效率的比較Liquid-liquidextraction具體實例基質(zhì)效應(yīng)的考察92.8%94.4%84.8%87.9%1.考察了不同提取溶劑對基質(zhì)效應(yīng)的影響。2.考察了內(nèi)標化合物對待測化合物受基質(zhì)影響的隨動性。具體實例稀釋倍數(shù)的考察準確性和精密度的考察具體實例SC毒代研究-90天長期毒性試驗犬體內(nèi)暴露情況具體實例SC毒代研究-90天長期毒性試驗毒代參數(shù)1.采血時間點的頻度足以評價SC在犬體內(nèi)的暴露水平。2.雌雄無明顯差別。在考察的劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性藥動學特征。提示無明顯的藥物消除的飽和或藥物代謝酶的誘導(dǎo)和抑制現(xiàn)象出現(xiàn)。具體實例3.ToxicokineticsappilicationinthedevelopmentofPNU-101017ToxicokineticsinDrugDevelopment:AnOverviewofToxicokinetic

ApplicationintheDevelopmentofPNU-101017,anAnxiolyticDrug

Candidate具體實例severalquestionswereaskedWhatisthemechanismofdeath?IsthetoxicityofPNU-101017mediatedbythedrugeffectsonthecentralnervoussystem?Willthetargetorganexposure,suchasbrain,bemorerelevanttothetoxicitythanthesystemiccirculation?Willthespeciesdifferencesinproteinbindingleadtothedifferenceinlethalserumconcentrationsbetweendogsandrats?Istheremarkedspeciesdifferenceinsensitivitytothetoxiceffectsinadditiontospeciesdifferencesinexposure?ComparisonofPNU-101017serumconcentration-timeprofilesinthedogfollowing40mg/kg/dayoraladministration(●)andcontinuousivinfusionatarateof360mg/min/kg(21mg/h/kg)(■)ofPNU-101017.

Dog：死亡時血藥濃度7-11μgPNU-101017serumconcentrations-timeprofiles(left)orCSFconcentration-timeprofiles(right)inthedog(●)andmonkey(□)followingacontinuousintravenousinfusion(n=3).Dogswereinfusedat360mg/min/kgfor2to3hoursandmonkeyswereinfusedat310mg/mlfor4hoursfollowedby410mg/min/kgfor5hserumCSFPNU-101017Serum,BrainandCSFConcentrationsatLethalityintheDogandMonkeyfollowingContinuousIntravenousInfusionofPNU-101017*

RelationshipofPNU-101017CSF/SerumconcentrationsratioversustimeinBeagledogs(●)andCynomolgusmonkeys(□)followingcontinuousintravenousinfusion(n=3).

RelationshipofClinicalSignsandPNU-101017ConcentrationsinSerumandinCSF

SteepdoseresponseSerumconcentration-timeprofilesofPNU-101017(□)andPNU-172256(●)inthedog(n=4)followingintravenousinfusionofaPNU-101017solutionat360mg/min/kgfor4hwithsupportiverespirationviaaventilatorusingpureoxygen.

Bloodsampleswerecollectedupto72haftertheinitiationofinfusion.

ComparisonofPharmacokineticsofPNU-101017inmdr1a(-/-)-andmdr1a(+/+)Mice*

BloodBrainBarrierCONCLUSIONSThetoxiceffectsofPNU-101017developedrapidly,showin