28天重復劑量經(jīng)口毒性試驗方法

附件828天重復劑量經(jīng)口毒性試驗方法RepeatedDose28-DayOralToxicityStudy1范圍本規(guī)范規(guī)定了嚙齒類動物28天重復劑量經(jīng)口毒性試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料的28天重復劑量經(jīng)口毒性的評價。2試驗?zāi)康耐ㄟ^本試驗確定28天經(jīng)口連續(xù)接觸化妝品原料引起的毒性效應(yīng)，了解其作用靶器官和劑量-反應(yīng)關(guān)系，并估計未觀察到有害作用劑量，初步評價化妝品原料經(jīng)口的安全性，并為慢性經(jīng)口毒性試驗的劑量、觀察指標、毒性終點的選擇提供參考信息。3定義未觀察到有害作用劑量no-observedadverseeffectlevel（NOAEL）是指通過動物試驗，以現(xiàn)有的技術(shù)手段和檢測指標未觀察到任何與受試物有關(guān)的毒性作用的最大劑量。4試驗基本原則化妝品原料以不同劑量每日經(jīng)口給予各組實驗動物，連續(xù)染毒28天。實驗期間每日觀察動物的毒性反應(yīng)，死亡或瀕死動物盡可能進行大體解剖、血液生化指標檢測及組織病理學檢查。實驗結(jié)束后所有存活動物實施安樂死后進行大體解剖、臨床檢查。部分實驗動物的組織器官進行組織病理學檢查。5試驗方法5.1實驗動物5.1.1動物選擇實驗動物應(yīng)符合國家標準相應(yīng)規(guī)定。選擇已有資料證明對受試物敏感的動物物種和品系，嚙齒類動物通常首選年輕的成年大鼠（一般選用6~8周齡，不超過9周齡），試驗開始時動物體重的差異應(yīng)不超過平均體重的±20%。如果長期毒性試驗的劑量設(shè)計需要參考該試驗的劑量設(shè)計，則兩個試驗應(yīng)選用相同種系和來源的實驗動物。每組實驗動物至少10只（雌雄各半），如果試驗中期計劃剖檢動物，則應(yīng)相應(yīng)增加每組動物數(shù)量。另外，對照組和最高劑量組均應(yīng)設(shè)定一個衛(wèi)星組（每組10只，雌雄各半），在染毒結(jié)束后繼續(xù)觀察至少14d，用于了解受試物毒性作用的持續(xù)性、可逆性和遲發(fā)性。5.1.2飼養(yǎng)條件實驗動物及實驗動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用標準配合飼料，飲水不限制。動物按組別、性別分籠飼養(yǎng)，每籠動物數(shù)量應(yīng)滿足動物最低需要的空間，不影響動物自由活動和觀察動物的體征為宜。5.2劑量設(shè)計至少設(shè)定3個受試物劑量組和1個對照組。除不接觸受試物外，對照組的其余處理均與受試物劑量組相同。最高劑量應(yīng)能引起動物毒性反應(yīng)，而不引起動物死亡或嚴重毒性反應(yīng)；最低劑量應(yīng)不出現(xiàn)任何可觀察到的毒性效應(yīng)，能確定NOAEL，若有人群接觸水平的資料，則最低劑量應(yīng)高于人群實際接觸水平；中劑量介于高、低劑量之間，可出現(xiàn)輕度的毒性效應(yīng)，若設(shè)多個中間劑量，則各劑量應(yīng)引起不同程度的毒性作用。如果有資料表明，化妝品原料接觸水平超過1000mg/kgBW/d時不會產(chǎn)生可觀察到的毒性作用，而且可以根據(jù)相關(guān)結(jié)構(gòu)化合物預(yù)期其毒性時，可考慮不進行三個劑量水平的試驗。5.3受試物制備當受試物需使用溶媒配制成溶液或混懸液時，溶媒首選水，其次為植物油（如橄欖油、玉米油等），不溶于水或油的受試物亦可使用羧甲基纖維素、淀粉等配成混懸液。如果使用其他溶媒時，必須先了解其毒性特點。5.4試驗步驟實驗開始前，實驗動物需適應(yīng)實驗環(huán)境至少5d。實驗動物隨機分組。受試物可通過灌胃、摻入飼料或飲水進行染毒，具體方法應(yīng)當根據(jù)受試物的物理、化學特性及其毒代動力學試驗結(jié)果而定。試驗期間所有動物染毒的方式應(yīng)完全相同。5.4.1灌胃灌胃體積一般不超過10mL/kgBW，且各組染毒體積相同，每日在大致相同時間段灌胃，每周至少稱體重2次，根據(jù)體重調(diào)整灌胃體積。如為水溶性的受試物最大灌胃體積可達到20mL/kgBW。當受試物使用溶媒配制時，對照組應(yīng)給予相同體積的溶媒。5.4.2摻入飼料以不影響動物攝食、營養(yǎng)平衡為原則，將受試物與飼料充分混勻并保證受試物配制物的穩(wěn)定性和均一性。受試物摻入量一般不超過5%（w/w），>5%時需調(diào)整飼料營養(yǎng)素水平，使各劑量組與對照組飼料營養(yǎng)素水平一致。5.4.3摻入飲水以不影響動物飲水量為原則，將受試物與水混勻并保證溶液的穩(wěn)定性和均一性。每日新鮮配制。5.5觀察指標5.5.1臨床觀察觀察期限為28d。衛(wèi)星組在實驗結(jié)束后還要繼續(xù)觀察至少14d，不做任何處理，以了解毒性作用的可逆性、持續(xù)性及遲發(fā)性。每日應(yīng)至少觀察動物1次，觀察時間段盡量相同，或在預(yù)期毒性反應(yīng)出現(xiàn)的時間段觀察，記錄毒性反應(yīng)的癥狀、發(fā)生時間、持續(xù)時間等。如果出現(xiàn)毒性反應(yīng)，則應(yīng)適當增加每日觀察次數(shù)。觀察應(yīng)至少包括如下內(nèi)容：皮膚和被毛的改變、眼和粘膜變化、呼吸、循環(huán)、植物神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體運動和行為活動等改變。5.5.2體重、攝食量及飲水消耗量應(yīng)記錄和計算每周的體重、攝食量變化。當通過飲水染毒時應(yīng)記錄每日飲水量。如受試物經(jīng)摻入飼料或飲水給予，應(yīng)計算和報告受試物各劑量組實際攝入劑量。5.5.3臨床檢查進行臨床檢查前動物應(yīng)禁食過夜，麻醉后取空腹血測定。5.5.3.1血液學檢查在染毒結(jié)束及衛(wèi)星組觀察結(jié)束后，應(yīng)測定白細胞計數(shù)及分類、紅細胞計數(shù)、紅細胞壓積、血紅蛋白濃度、血小板計數(shù)、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)、凝血功能。如果受試物或其代謝物具有氧化性，還應(yīng)測定高鐵血紅蛋白濃度和海因茨小體。5.5.3.2血清生化檢查在染毒結(jié)束及衛(wèi)星組觀察結(jié)束后進行，檢查指標包括電解質(zhì)平衡、碳水化合物代謝、肝、腎功能。可根據(jù)受試物作用特點選擇其他特殊檢查。指標包括：鈉離子、鉀離子、葡萄糖、總膽固醇、尿素、肌酐、總蛋白、白蛋白、至少兩種反映肝功能的酶（如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、r-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和山梨醇脫氫酶等）、膽酸。根據(jù)受試物已有信息，必要時可增加一些血清標志物的測定，如鈣、磷、甘油三酯、激素、膽堿酯酶等。此外，還可根據(jù)所觀察到的毒性作用進行其它的臨床生化檢查，以便進行全面的毒性評價。5.5.3.3尿液檢查一般不需要檢查。如果根據(jù)受試物的作用特點需要進行尿液檢查的時候，應(yīng)在試驗的最后一周收集尿液，記錄尿液外觀，測定尿比重、pH、尿蛋白、尿糖和潛血等。5.5.3.4血漿或血清可以-20℃保存，當受試物可能有內(nèi)分泌效應(yīng)時，用于檢測甲狀腺激素（T3、T4）和促甲狀腺激素（TSH）。5.5.4組織病理學檢查5.5.4.1大體解剖所有動物均應(yīng)進行系統(tǒng)的大體解剖，內(nèi)容包括動物的體表、顱、胸、腹腔及其臟器。需要剖檢的臟器有：心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、睪丸、附睪、子宮（含子宮頸）、卵巢、前列腺+精囊（含凝固腺）、胸腺、眼、腦（包括大腦、小腦、延髓/腦橋）、甲狀腺/甲狀旁腺、氣管、胃、小腸和大腸（十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸）及腸系膜淋巴結(jié)、膀胱、陰道、胸骨（包括骨髓）、骨骼肌、坐骨神經(jīng)、脊髓（包括頸、胸、腰段）和病變組織。將上述組織和器官保存在固定液中，以備組織病理學檢查。需要稱量的臟器有：心、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢、前列腺+精囊（含凝固腺）、胸腺、腦、甲狀腺。計算臟器系數(shù)（以g/100gBW或mg/100gBW表示），上述臟器應(yīng)在分離后盡快稱重以防水分丟失。當毒性作用提示可能為受試物的靶器官時，也需要剖檢并進行組織病理學檢查。當受試物可能有內(nèi)分泌效應(yīng)時，應(yīng)關(guān)注內(nèi)分泌敏感指標。必選指標有睪丸、附睪、前列腺+精囊（含凝固腺）、腎上腺重量及睪丸、附睪、前列腺+精囊（含凝固腺）、卵巢、子宮（含子宮頸）、腎上腺、甲狀腺、陰道組織病理學檢查。可選指標有卵巢、子宮（含子宮頸）、甲狀腺重量及雌性陰道涂片、雄性乳腺、垂體組織病理學檢查。雌性動物陰道涂片，用于推斷動物的動情周期與性腺器官組織器官組織結(jié)構(gòu)是否同步，同步性發(fā)生改變提示受試物有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。5.5.4.2組織病理學檢查應(yīng)對以下組織器官進行檢查，病變組織給出組織病理學照片：（1）對照組、最高劑量組剖檢的組織器官需進行病理學檢查。如果最高劑量組某組織器官出現(xiàn)病理學改變，則其它劑量組的相應(yīng)組織器官也應(yīng)進行病理學檢查。（2）各劑量組大體解剖肉眼觀察有異常的組織器官。（3）在受試物劑量組出現(xiàn)毒性作用的組織器官，衛(wèi)星組應(yīng)對其進行病理學檢查。6試驗結(jié)果評價對所有數(shù)據(jù)應(yīng)采用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法進行分析。將臨床觀察、組織病理學檢查結(jié)果，結(jié)合體重、攝食量、臨床檢查數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果進行綜合分析，初步判斷