凝血因子Ⅶ啟動子區(qū)甲基化調(diào)控基因表達及與顱腦創(chuàng)傷后進展性出血性損傷相關(guān)性研究

凝血因子Ⅶ啟動子區(qū)甲基化調(diào)控基因表達及與顱腦創(chuàng)傷后進展性出血性損傷相關(guān)性研究本課題分三部分,第一部分從臨床角度闡述單純性顱腦創(chuàng)傷(traumaticbraininjury,TBI)患者血漿凝血因子VII活性(coagulationfactorVIIactivity,CFVIIa)水平與顱內(nèi)進展性出血性損傷(progressivehemorrhagicinjury,PHI)的相關(guān)性;第二和第三部分分別從細胞和臨床角度研究凝血因子VII(coagulationfactorVII,CFVII)啟動子區(qū)甲基化對CFVII基因表達調(diào)控作用及與PHI的相關(guān)性。各部分研究摘要如下:第一部分單純性顱腦創(chuàng)傷患者血漿凝血因子VII活性水平與顱內(nèi)進展性出血性損傷的相關(guān)性目的:研究單純性TBI患者血漿CFVIIa水平與PHI的相關(guān)性。方法:根據(jù)研究納入和排除標準選取2010年8月至2014年6月在上海華山醫(yī)院神經(jīng)創(chuàng)傷中心急診入院的年齡≥17歲的中重度單純性TBI患者112例,采集患者入院時外周靜脈血標本并送檢國際標準化比值(internationalnormalizedratio,INR)、活化部分凝血活酶時間(activeatedpartialthromboplastingtime,APTT)、血小板(platelet,PLT)、D-二聚體、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)及CFVIIa。每24h隨訪患者頭顱CT一次,當再次CT掃描較首次CT掃描顯示的出血性病灶擴大或有新出現(xiàn)的出血性病灶時被診斷為PHI。結(jié)果:PHI組患者血漿CFVIIa及PLT水平均顯著低于非PHI組(77.79%±22.82%VS100.32%±30.39%;126.95±48.46VS148.13±53.41;P<0.05);PHI組患者血漿APTT、INR、D-二聚體、FIB均高于非PHI組,但兩組之間差異不明顯(P>0.05)。Logistic回歸分析,結(jié)果顯示血漿CFVIIa低下(OR=1.06,95%CI=1.03~1.10,P<0.001)及PLT水平降低(OR=1.01,95%CI=1.00~1.02,P=0.009)是單純性TBI患者發(fā)生PHI的獨立危險因素。結(jié)論:單純性TBI后PHI患者血漿CFVIIa及PLT水平均顯著低于非PHI患者,血漿CFVIIa低下及PLT水平降低是單純性TBI患者發(fā)生PHI的獨立危險因素。第二部分凝血因子VII啟動子區(qū)甲基化調(diào)控凝血因子VII表達目的:研究CFVII基因啟動子區(qū)甲基化對CFVII表達調(diào)控作用。方法:基因合成CFVII啟動子區(qū)-781--1bp及-1000--1bp兩條片段,并將上述片段亞克隆至PGL3-basic載體,獲得重組質(zhì)粒PGL3-F7UM-781--1、PGL3-F7UM-1000--1。酶切、測序驗證無誤后,用甲基化轉(zhuǎn)移酶(M.SssI,NEB)對重組質(zhì)粒、PGL3-Basic、PGL3-Control質(zhì)粒進行全甲基化修飾得到甲基化質(zhì)粒。本實驗共分9組,分別為無轉(zhuǎn)染對照、PGL3-Basic(UM)、PGL3-Basic(M)、PGL3-Control(UM)、PGL3-Control(M)、PGL3-F7UM-781--1、PGL3-F7M-781--1、PGL3-F7UM-1000--1、PGL3-F7M-1000--1。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別將以上質(zhì)粒及對照質(zhì)粒PRL-TK轉(zhuǎn)染入人肝癌細胞(HepG2),檢測熒光素酶活性。結(jié)果:各組甲基化質(zhì)粒較未甲基化質(zhì)粒熒光素酶表達水平均顯著降低(P<0.001)。其中PGL3-F7M-781--1組熒光素酶表達較PGL3-F7UM-781--1組下降了約110倍(P<0.001);而PGL3-F7M-1000--1組較PGL3-F7UM-1000--1組熒光素酶表達下降約244倍(P<0.001)。兩組非甲基化重組質(zhì)粒熒光素酶表達水平無明顯差異(P=0.28);而兩組甲基化重組質(zhì)粒熒光素酶表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)論:CFVII啟動子區(qū)甲基化影響CFVII基因表達,啟動子區(qū)高甲基化將導(dǎo)致CFVII基因表達降低。位于啟動子區(qū)-781bp至-1000bp之間的CpG甲基化對CFVII基因表達影響更顯著。第三部分單純性顱腦創(chuàng)傷患者血漿凝血因子VII啟動子區(qū)甲基化與凝血因子VII活性水平及顱內(nèi)進展性出血性損傷相關(guān)性研究目的:研究單純性TBI患者血漿CFVII啟動子區(qū)甲基化水平與血漿CFVIIa水平之間關(guān)系,并探討CFVII啟動子區(qū)甲基化與PHI的相關(guān)性。方法:選取符合條件的中重度單純性TBI患者79例,采集患者入院時外周靜脈血,并送檢CFVIIa、PLT、APTT、INR、FIB、D-二聚體。提取患者血液基因組DNA,并對其進行亞硫酸氫鹽處理,設(shè)計合成引物,PCR擴增目的基因片段,采用Sequenom質(zhì)譜法檢測患者CFVII啟動子區(qū)甲基化水平。本實驗共采用兩種分組方法:CFVIIa≥90%組與CFVIIa<90%組,PHI組與非PHI組。PHI定義與前述相同。結(jié)果:采用獨立樣本T檢驗對所研究的FVII啟動子區(qū)CpG位點進行比較發(fā)現(xiàn):CFVIIa≥90%組與CFVIIa<90%組患者CpG3位點甲基化率有顯著性差異(0.83±0.05VS0.85±0.03,P<0.05),CFVIIa≥90%組患者CpG3位點甲基化率小于CFVIIa<90%組;而兩組患者CpG2、CpG4、CpG5、CpG6等位點甲基化率無顯著性差異(P>0.05);PHI組與非P