實(shí)驗(yàn)3-微生物接種技術(shù)及實(shí)驗(yàn)4 血液凝固和影響血液凝固的因素

實(shí)驗(yàn)三微生物接種技術(shù)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握無(wú)菌操作在微生物接種過(guò)程中的重要性。2、掌握幾種常用的微生物接種方法。3、掌握微生物微生物擴(kuò)大繁殖的基本方法。4、認(rèn)識(shí)微生物接種工具二、實(shí)驗(yàn)原理微生物接種技術(shù)是生物科學(xué)研究中最基本的操作技術(shù)。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、培養(yǎng)基種類及容器等不同，所用接種方法不同，如斜面接種、液體接種、固體接種和穿刺接種等，以獲得生長(zhǎng)良好的純種微生物。為此，接種必須在一個(gè)無(wú)雜菌污染的環(huán)境中進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作；同時(shí)，因接種方法的不同，常采用不同的接種工具，如接種針、接種環(huán)、移液管和玻璃刮鏟等。三、實(shí)驗(yàn)器材主要儀器及設(shè)備無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、振蕩器、接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種鏟，試管固體斜面培養(yǎng)基、培養(yǎng)基平板、三角瓶液體培養(yǎng)基，PDA平板及斜面，牛肉膏-蛋白胨-瓊脂平板、斜面培養(yǎng)基、牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基、試管半固體培養(yǎng)基。菌種大腸桿菌（Escherichiacoli)、青霉(Penicilliumsp．)、釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeHansen)、細(xì)黃鏈霉菌(Streptomycesmicroflavus)放線菌等。四、操作步驟(一)斜面接種技術(shù)具體操作如下：1、貼標(biāo)簽接種前在試管上貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等。貼在距試管口徑2-3厘米的位置。2、點(diǎn)燃酒精燈。3、接種用接種環(huán)將菌種移接到貼好標(biāo)簽的試管斜面上。無(wú)菌操作程序簡(jiǎn)述如下：⑴手持試管將菌種和用于接種的斜面兩支試管用大拇指和其他四指握在左手中、使中指位于兩試管之間。斜面向上，并使它們位于水平位置(圖a)。⑵旋松棉塞先用右手將棉塞旋松，以便接種時(shí)易于拔出。⑶取接種環(huán)右手拿接種環(huán)在火焰將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部分，均用火燒過(guò)滅菌。⑷拔棉塞用右手的無(wú)名指、小指和手掌邊先后拔出試管的棉塞，然后讓試管口緩緩過(guò)火滅菌(切勿燒得過(guò)燙)，如圖b、c所示。⑸環(huán)冷卻將灼燒過(guò)的接種環(huán)伸入菌種管，先使環(huán)接觸沒(méi)有長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻。⑹取菌種待環(huán)冷卻后輕輕沾取少量菌或孢子，然后將接種環(huán)移出接種管，如圖d所示，注意不要使環(huán)的部分碰到管壁，取出后不可使環(huán)通過(guò)火焰。⑺接種在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管。從斜面培養(yǎng)基的底部向上部作“之”字形來(lái)回劃線，方向是從下部開(kāi)始，一直劃至上部，勿劃破培養(yǎng)基(圖e)。有時(shí)也可用接種針僅在斜面培養(yǎng)基的中央劃一條線作斜面接種，以便觀察菌種的生長(zhǎng)特點(diǎn)。⑻塞棉塞取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將棉塞塞上。塞棉塞時(shí)，不要用試管迎棉塞，以免試管在移動(dòng)時(shí)帶入不潔空氣，如圖f、g所示。⑼環(huán)滅菌將接種環(huán)燒紅滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊，如圖所示。斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作（二）穿刺接種

（1）取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白胨柱狀培養(yǎng)基，做好標(biāo)記（寫上菌名）、接種日期，接種人等）。（2）接種的方法是，用接種針沾取少量待接菌種，然后從柱狀培養(yǎng)基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路線抽出接種針，注意接種針不要移動(dòng)。（3）接種后30℃恒溫培養(yǎng)，24h后觀察，比較兩種菌的生長(zhǎng)結(jié)果。

穿刺接種示意圖

穿刺接種示意圖

（三）液體接種1、用斜面菌種接種液體培養(yǎng)基，分為兩種情況：（1）如接種量小，可用接種環(huán)（鏟、針等）取不量菌體移入培養(yǎng)基容器中，將環(huán)在液體表面處的器壁上輕輕摩擦，使菌苔碾散；抽出接種環(huán)再搖動(dòng)液體培養(yǎng)基使菌體均勻分布在液體中。（2）如接種量大，可先在斜面菌種管中倒入一定量的無(wú)菌水，用接種環(huán)將菌苔刮下，再將菌懸液倒入液體培養(yǎng)基中，倒前需將管口在火焰上灼燒滅菌。（四）平板接種以中指、無(wú)名指及小指托住培養(yǎng)皿下蓋底部，用虎口及食指扶住上蓋，再將斜面菌種管放于培養(yǎng)皿上之上，以拇指壓住。然后以移菌環(huán)挑菌苔的菌體移入平板的中央，也可在平板上劃線3-5條。五、接種后的培養(yǎng)將接種后的試管、平板放適宜的條件下培養(yǎng)，分別于48h、72h后進(jìn)行觀察。六、報(bào)告1、觀察記述所有接種培養(yǎng)的微生物的形態(tài)特征、生長(zhǎng)情況等，結(jié)果填入表內(nèi)：觀察項(xiàng)目菌名(細(xì)菌)菌名(放線菌)菌名(霉母)菌名(酵母菌)形狀突起色素大小透明程度氣味干濕度2、思考題：1）接種前后為什么要灼燒接種環(huán)？2）為什么要待接種環(huán)冷卻后才能與菌種接觸？是否可以將接種環(huán)放在臺(tái)子上冷卻？如何如何知道接種環(huán)是否已經(jīng)冷卻？3）微生物接種為什么要在無(wú)菌條件下進(jìn)行？4）接種應(yīng)注意哪些環(huán)節(jié)才能避免雜菌污染？實(shí)驗(yàn)4血液凝固和影響血液凝固的因素【摘要】目的研究影響血液凝固的內(nèi)源性物質(zhì)。通過(guò)測(cè)定某些條件下的血液凝固時(shí)間，加深理解影響血液凝固的因素。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液采集，對(duì)照法。結(jié)果纖維蛋白，取出后血液不再凝固；少量生理鹽水、肺組織浸液、少量棉花能促進(jìn)凝血過(guò)程，減短凝血時(shí)間；肝素、草酸鉀、液體石蠟涂壁、冰水能夠減緩凝血過(guò)程，延長(zhǎng)凝血時(shí)間。結(jié)論內(nèi)源性影響血液凝固的因素—纖維蛋白，取出后血液不再凝固；外源性因素通過(guò)影響血液的酶促反應(yīng)來(lái)影響凝血。關(guān)鍵詞：凝血因子酶促反應(yīng)組織因子內(nèi)源性外源性目錄【摘要】 1關(guān)鍵詞 11. 實(shí)驗(yàn)材料和方法 21.1. 實(shí)驗(yàn)材料 21.2. 實(shí)驗(yàn)方法： 22. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 33. 實(shí)驗(yàn)討論（見(jiàn)附頁(yè)） 34. 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 35. 參考文獻(xiàn)： 3附頁(yè) 4實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：兔子（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）實(shí)驗(yàn)材料和器械：手術(shù)剪、手術(shù)鑷、試管、動(dòng)脈夾、動(dòng)脈插管、恒溫水浴、秒表。實(shí)驗(yàn)藥品：石蠟油，冰塊，草酸鉀，肝素，氯化鈣，氨基甲酸乙酯實(shí)驗(yàn)方法：用200g/L氨基甲酸乙酯（烏拉坦）按5ml/kg體重劑量給家兔耳緣靜脈注射麻醉，將兔子仰臥固定在兔手術(shù)臺(tái)上。切開(kāi)頸部皮膚后（先去除頸部兔毛），分離頸外靜脈，采血10ml，制備血漿和血清。分離一側(cè)的經(jīng)總動(dòng)脈，頭部用線結(jié)扎，向心端夾上動(dòng)脈夾。用眼科剪在近結(jié)扎線處的血管壁剪一個(gè)“V”字的小口，向心方向插入動(dòng)脈插管，用線結(jié)扎固定。以備取血之用。取8支試管，編號(hào)1-10。按照下圖準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)條件。組別實(shí)驗(yàn)試劑劑量1空白對(duì)照2棉花少許3石蠟油潤(rùn)滑整個(gè)表面4浸在盛碎冰塊的燒杯中5氯化鈉 1ml6肝素8單位（加血后搖勻）1ml7草酸鉀（加血后搖勻）0.1ml8肺組織浸液0.1ml9放血10ml，用竹簽不斷攪動(dòng)，2-10min后沖凈竹簽后觀察。1-8號(hào)試管各加入血液2ml。9、10號(hào)小燒杯放血10ml，9號(hào)小燒杯放血時(shí)用竹簽不斷攪動(dòng)。立即用秒表記時(shí)間，每隔15s將試管傾斜一次，觀察血液是否凝固，至血液成為凝膠狀記下時(shí)間。記錄時(shí)間。取竹簽一只，將燒杯內(nèi)的血液不停攪拌，取出粘附在竹簽上的纖維，觀察其形態(tài)，再靜置，并觀察血液凝集的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)討論（見(jiàn)附頁(yè)）實(shí)驗(yàn)結(jié)論（1）內(nèi)源性影響血液凝固的因素—纖維蛋白，取出后血液不再凝固，內(nèi)源性因素指參與凝血的因子全部存在于血漿中