異種克隆牦牛-羚牛及相關機理的研究

異種克隆牦牛，羚牛及相關機理的研究在保護瀕危動物和進行核質互作分析方面，異種克隆技術是非常有效的方法。本研究利用牛卵母細胞作為受體，通過顯微操作與牦牛或羚牛體細胞構建異種重構胚，將牦牛的異種重構胚移植到代孕牛中，獲得了妊娠，并有望于2004年6—7月間出生。此外本研究還對異種克隆技術和異種體細胞核重編程進行了初步探討。1供體細胞的培養(yǎng)：本實驗從北京動物園、青?；ブh、秦皇島野生動物園分別采集了羚牛和牦牛組織樣，建立了21個細胞系。細胞系種類包括耳成纖維細胞、輸卵管上皮、顆粒細胞系三種。實驗證明樣品采用0℃保存48小時，對細胞系的建立無負面影響。這為野外收集珍稀動物組織，建立細胞系提供了切實可行的方法。2體細胞克隆技術基礎平臺的建立：首先，在去核方法上，本實驗比較了H33342染色法，盲吸法和高滲法并結合這三種方法作了優(yōu)化，形成本實驗的去核方法：其次，本實驗利用牛卵母細胞孤雌激活的方法，比較了四種激活方法，發(fā)現(xiàn)利用復合激活方法比單個化學試劑激活效率高(83.6、68.7：45、62.5)，而在復合激活的方法中以A23187+6-DMAP激活效率較高(分裂率，83.6)；最后，通過比較M199培養(yǎng)液和CR1aa培養(yǎng)液對孤雌激活胚胎的培養(yǎng)效率，發(fā)現(xiàn)CR1aa培養(yǎng)液較適合牛胚胎的培養(yǎng)。3異種克隆牦牛囊胚研究：本實驗利用不同個體的牦牛耳成纖維細胞、顆粒細胞和輸卵管細胞，分別作為供核細胞移入去核牛卵母細胞中，均可完成體外牦牛的早期囊胚發(fā)育(囊胚率高達35％)。通過對不同年齡階段、不同個體、不同細胞類型、細胞的饑餓與否、細胞冷凍與否，以及卵母細胞成熟率，不同融合到激活時間對克隆效率的比較發(fā)現(xiàn)：卵母細胞的質量是克隆成功的基礎，當成熟率在40％以下時，將顯著影響異種克隆牦牛的囊胚發(fā)育(由25％降到3％，P＜0.01)；影響異種克隆牦牛早期囊胚發(fā)育的重要因素為延遲激活時間，當延遲激活1.5小時可顯著提高異種克隆囊胚率(由21％提高到35％，P＜0.05)；而不同類型細胞、不同個體、不同年齡、饑餓與否、冷凍與否對異種克隆牦牛早期囊胚發(fā)育影響不顯著，這為簡化供體細胞的處理提供了依據(jù)。4通過將羚牛和牦牛的異種克隆發(fā)育情況、囊胚總細胞數(shù)和克隆牛進行比較發(fā)現(xiàn)：(1)異種克隆羚牛胚胎在體外可以發(fā)育到囊胚階段，囊胚率為5％左右：(2)利用相同的克隆技術，同種克隆牛、異種克隆牦牛、異種克隆羚牛之間克隆效率差異顯著(48％；28％；5％，P＜0.01)(3)三種克隆囊胚的細胞數(shù)無差異。這些結果說明牛卵母細胞可以支持羚牛、牦牛、牛成纖維細胞核進行重編程，但是囊胚發(fā)育率種內(nèi)較異種克隆高(牛高于牦牛、羚牛)，物種間距離越近克隆效率越高(牦牛高于羚牛)。5由于異種克隆所用的卵母細胞不是同一物種，有必要對克隆后囊胚的核，線粒體遺傳物質進行鑒定。本實驗對異種克隆牦牛和羚牛囊胚鑒定結果表明：囊胚核基因組來自牦牛和羚牛供核中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文中文摘要細胞，說明本實驗獲得的囊胚是真正異種體細胞克隆的結果;囊胚線粒體以牛卵母細胞線粒體為主，耗?；蛄缗９w細胞線粒體含量甚微。6異種克隆耗牛胚胎進行移植:共移植耗牛胚胎185枚，用受體牛60頭，其中有近33頭的受體牛返情期延長，移植后第60天直腸檢查確認有3頭懷孕。7個月后，1頭牛妊娠仍然正常，為通過異種克隆的方法保護珍稀動物提供了依據(jù)。7目前在較近的物種之間進行異種體細胞克隆雖然已有成功的報道，但是多數(shù)報道的異種體細胞克隆都發(fā)育到囊胚階段，最多妊娠幾個月。本實驗在異種克隆耗牛實驗中也發(fā)現(xiàn)了這一問題。為了較全面的探索其基因方面的原因，則需要對大量的候選基因進行分析。而利用傳統(tǒng)的RT一PCR方法從單個卵母細胞或胚胎中獲得的RNA量不足以分析大量的基因。本研究利用并優(yōu)化了一套全新的擴增細胞中整體cDNA的方法，使微量材料進行大量的基因表達分析成為現(xiàn)實。通過該方法，本實驗檢測了6個重要基因在耗牛體細胞和牛卵母細胞和耗牛異種體細胞克隆胚胎的表達情況;同時對耗牛異種體細胞克隆囊胚的內(nèi)細胞團/總細胞的比例進行了檢測。結果表明耗牛體細胞功能基因波形蛋白基因和膠原蛋白基因只在耗牛細胞中檢測到，說明耗牛體細胞的基因表達得到了重編程。發(fā)現(xiàn)cx43和乃油乙夕這兩個對細胞和胚胎重要的基因在耗牛細胞和胚胎中均表達;兩個對胚胎發(fā)育重要的基因人吸”hZ和116不在供體細胞中表達，在胚胎中有表達，但其起始表達的時期異常。耗牛異種體細胞克隆囊胚的內(nèi)細胞比例顯著高于牛人工受精囊胚。由此可推測，滋養(yǎng)層細胞比例過少和胚胎發(fā)育重要的基因表達起始時期異?？赡芘c異種體細胞克隆胚胎妊娠困難和流產(chǎn)率高有關。8在此次研究中發(fā)現(xiàn)，作為干細胞標志的Ocl4基因在牛和耗牛體外培養(yǎng)的細胞系中也有大量表達。利用原