多西紫杉醇誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡機制的研究

AbstractStudyontheeffectofdocetaxelontumorcellproliferationinhibitionandintumorchemotherapy,takethecellcount,morphologicobservation,flowcytometrymethodforthedetectionandobservationrespectivelyandcombinedwithdocetaxelonproliferationofhumantumorcelllinesinnudemicebearinghumantumorinhibition;toestablishanimalmodel,totreatseparatelyandcombinedwithdocetaxel,andblankcontrol.Observationofgrowthandpathologicalcharacteristicsofthetumorbody.ThroughtheexperimentsofMTTdetectiontestofdocetaxelontumorcellproliferationinhibition.Usingdifferentconcentrationsoftumorcellsuppressiontest,theinfluenceoftheconcentrationonthesurvivaloftumorcells.Theexperimentisdividedintotwoparts,respectively,andMTTdetectionofcellculture.Keywords:DocetaxelStemcellsResearchApplication前言紫杉類藥物屬于紅豆杉的樹皮或針葉中提取或半合成的新抗腫瘤藥物，作用在微管以及微管蛋白系統(tǒng)，紫杉類藥物與其他植物堿不同，紫杉類藥物通過促進微管雙聚體裝配成微管通過防止去多聚化過程而使微管穩(wěn)定，阻滯細胞于G和M期，從而抑制癌細胞的有絲分裂和增殖。目前該類藥物臨床上有紫杉醇和多西紫杉醇docetaxe1等。采用多西紫杉醇治療法具有來源廣泛、容易獲取、可迅速擴增、自體移植無免疫排斥等諸多優(yōu)勢，使其在細胞治療及組織工程方面具有重要的研究價值及廣闊的應(yīng)用前景。第1章儀器與試劑1.1材料和試劑多西紫杉醇；A549細胞（肺腫瘤細胞）M-231（乳腺腫瘤細胞）hepg2（肝腫瘤細胞）PC3（前列腺腫瘤細胞）；二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、PBS,購自于索萊寶；完全RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清(NBS)，購自于南京凱基生物技術(shù)有限公司；TUNEL細胞原位凋亡測定試劑盒、活性氧試劑盒及細胞周期檢測試劑盒（購自于南京凱基生物技術(shù)有限公司）、ELISA試劑盒、Westernblot檢測試劑盒。其它試劑均為分析純。1.2儀器二氧化碳孵箱（Thermo）；單人雙面超凈工作臺（SW-CJ）；倒置式生物顯微鏡（XDS-1B）；酶標(biāo)儀（Infinitef200）；流式細胞儀（FACSCalibur）；高速離心機（TGL-16G）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-600DB）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A上海亞榮生化儀器廠）、恒溫干燥箱（施都寶Bao-80A）、恒溫水浴鍋(HW.SY21-K)、超低溫冰箱（thermo）。第2章實驗方法2.1細胞培養(yǎng)A549細胞的培養(yǎng)A549細胞為人肺腺癌細胞，屬于傳代細胞系，可穩(wěn)定地傳代培養(yǎng)。一般用胰酶消化后，加入生長液稀釋，以1：2～1：3傳代培養(yǎng)都是可行的。一、[所需溶液]細胞沖洗液：磷酸鹽緩沖液(PBS)——無Ca、Mg名稱用量NACL8.00gKCL0.20KH2PO40.20Na2HPO4.。12H2O1.15加水至1000mL,將PH調(diào)至7.4，高壓滅菌。消化液胰酶-PBS名稱用量結(jié)晶胰酶2.5g高壓滅菌后的PBS1000ml用磁力攪拌器攪拌均勻，使其完全溶解，通過0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝備用，放置—20℃保存。胰酶—EDTA:名稱用量結(jié)晶胰酶0.5gEDTA鹽溶液0.2g無Ca、MgPBS1000ml用磁力攪拌器攪拌均勻，使其完全溶解，通過0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝備用，放置—20℃保存。細胞培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)液配制方法：將一袋干粉型RPMI1640培養(yǎng)基溶于900ml三蒸水中，沖洗包裝袋兩至三次倒入培養(yǎng)液中。加入丙酮酸鈉0.1g，NaHCO22g以及雙抗，加入磁力攪棒并置于磁力攪拌器上充分攪拌。雙抗的配置濃度為100U/ML青霉素和100U/ML鏈霉素。(一般市售的青霉素為80萬U/瓶，將其溶解于4ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加入0.5ml；市售的鏈霉素為100萬U/瓶，將其溶解于5ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加入0.5ml)。調(diào)整培養(yǎng)液的ＰＨ值，用ＰＨ精密試紙觀察ＰＨ７.２～７.４即可。過濾法除菌，所使用的濾器為Ｏ２加壓過濾，０.２２μｍ濾膜，濾膜事先采用高壓滅菌消毒。分裝，加蓋瓶塞，加封紗布報紙，用繩固定，放置—20℃保存。2.2細胞的維持和培養(yǎng)2.2.1細胞的復(fù)蘇（1）準備37℃恒溫水浴鍋，從液氮罐中取出存有Ａ５４９細胞的凍存管，迅速放于37℃溫水中，用鑷子夾住輕輕搖動使其迅速融化。（2）800r，10min離心。（3）在無菌操作臺中采用75%的乙醇徹底擦拭凍存管，然后打開凍存管，注意動作要輕柔。（4）用1ml槍頭將上清液去除，加入1ml預(yù)熱的細胞培養(yǎng)液將細胞吹散開，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中。（5）補充4ml的RPMI1640培養(yǎng)基，并且添加10%的胎牛血清。(培養(yǎng)基中含有牛血清則不用添加）（6）倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養(yǎng)。（7）24h后，更換新的培養(yǎng)液。（8）常規(guī)傳代培養(yǎng)。2.2.2A549細胞更換新的培養(yǎng)液（1）無菌操作打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，倒掉培養(yǎng)液。（2）用PBS反復(fù)沖洗細胞2～3遍。（3）加入新鮮的預(yù)熱好的培養(yǎng)液及10%的胎牛血清。各種液體需要量（ml）表面積25cm275cm2150cm2洗滌3510胰酶1～21～32～5培養(yǎng)液51020倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養(yǎng)。2.2.3A549細胞的傳代無菌操作打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，倒掉培養(yǎng)液。向已經(jīng)長滿的細胞中加入消化液1ml，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有的細胞表面，吸棄或倒掉，輕輕沖洗細胞表面2～３遍，以盡可能去除原培養(yǎng)液中的牛血清。加入1ml消化液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育5～８min后把培養(yǎng)瓶放置在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞的胞質(zhì)回縮、胞間質(zhì)增大后，立即終止消化。加入5ml預(yù)熱至37℃的培養(yǎng)液，用玻璃吸管反復(fù)吹打以分散細胞。吹打過程按順序進行，從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有的底部都被吹到。吸取一半的細胞懸液，接種到新的25cm2培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)液，并且添加10%～20%的胎牛血清。通常每瓶液體量為5～10ml。倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養(yǎng)。2.3分組給藥在37℃，恒濕的5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)A549細胞，完全培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基中含10%新生小牛血清，加入100μg/ml鏈霉素和100μg/ml氨芐青霉素。細胞為上皮樣貼壁生長，每2～3d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將細胞分為五組：空白對照組、模型組、多西紫杉醇高、中、低劑量組。加藥前先將多西紫杉醇溶于DMSO中，再用完全培養(yǎng)基稀釋，使藥物終濃度為200mg/L、100mg/L、50mg/L，DMSO終體積為1‰，空白對照組及模型組加入含1‰DMSO完全培養(yǎng)基。藥物預(yù)處理4h后，24h后檢測各項指標(biāo)。2.4MTT溶液的配置與檢測MTT全稱為3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，漢語化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。2.4.1配制稱取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4oC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。2.4.2貼壁細胞

1、收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.、5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔.3.、5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6、每孔加入150ul二甲基亞砜，低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）第3章實驗計算以及結(jié)果3.1計算IC50(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應(yīng)率之和Pm:最大陽性反應(yīng)率Pn:最小陽性反應(yīng)率3.2實驗結(jié)果PC3人前列腺細胞原料藥脂質(zhì)體N10微克/毫升10.10.01lipo0.01微克/毫升lipo0.1lipo1lipo100.720.2240.2670.3570.3740.3810.4330.3340.2310.5980.2510.2680.3520.3870.580.3380.2720.2230.5380.2310.2860.3270.3460.5210.3830.2740.2430.5470.3020.2670.3050.3810.410.4260.310.2710.5230.3160.2920.3040.3930.4090.40.3120.2020.5820.3140.3510.3110.3850.4750.330.3370.2320.58460.273028850.3260.377660.4626666670.3850.30650.233666667666766670.5330672750.5065564420.4424173320.3540478910.2086659060.3415051310.4757696690.600342075IC50=1.82微克/毫升IC50=3.2微克/毫升由于多西紫杉醇脂質(zhì)體的載藥量為10%，故脂質(zhì)體的IC50折合成原料藥的話，應(yīng)在現(xiàn)有IC50的基礎(chǔ)上*10%.原料藥脂質(zhì)體0.010.1110lipo10lipo1lipo0.1lipo0.010.9210.7940.6080.5980.6070.5880.6180.630.6020.7650.6440.6490.5660.5950.4720.5810.6450.5510.6480.6630.6360.6080.6030.5940.5780.6220.7540.6140.6770.6680.6520.6130.5420.5190.6410.6990.6890.6480.6660.6560.5860.5780.6520.6140.7290.7530.7180.6940.6710.5480.5770.6360.6510.7590.7316666670.6906666670.65350.6251666670.5920.55850.5973333330.6338333330.6823333330.0560364460.1068337130.1455580870.1908883830.236674260.1835990890.1337129840.067425968IC50=41.3微克/毫升IC50=3.7微克/毫升A549肺腫瘤細胞結(jié)語綜合全文內(nèi)容可總結(jié)出多西紫杉醇可能通過兩種方式殺傷腫瘤細胞：（1）直接殺傷作用：多西紫杉醇通過靶細胞受體，或不同于TCR復(fù)合體的識別機構(gòu)，識別靶細胞。并與其結(jié)合，多西紫杉醇與靶細胞的結(jié)合。啟動細胞溶解反應(yīng)，釋放一些細胞毒顆?；蛞蜃樱瑥亩芙獍屑毎?；（2）間接殺傷作用：多西紫杉醇除自身直接溶解靶細胞外，還能分泌IL-2，腫瘤壞死因子(TNF)，r-干擾素(r-TFN)等多種細胞因子對腫瘤細胞產(chǎn)生間接殺傷作用，此類因子對腫瘤細胞均有直接的細胞毒活性或抑制作用。多西紫杉醇和LAK細胞一樣具有廣譜的非MHC限制的殺傷腫瘤細胞的作用，但兩者的殺瘤譜有所不同