斑蘭葉及其制品中角鯊烯的測(cè)定

1斑蘭葉及其制品中角鯊烯的測(cè)定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了斑蘭葉及其制品中角鯊烯含量的三種測(cè)定方法：氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于斑蘭葉、斑蘭粉、斑蘭漿及斑蘭制品中角鯊烯的測(cè)定。當(dāng)稱(chēng)取樣品0.2g時(shí)，氣相色譜法的定量限為50mg/kg，氣相色譜-質(zhì)譜法的定量限為2.5mg/kg，高效液相色譜法的定量限為30mg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T3673植物油中角鯊烯SN/T4785出口植物油中角鯊烯的測(cè)定LS/T6120糧油檢驗(yàn)植物油中角鯊烯的測(cè)定氣相色譜法T/GDWJ001食用斑蘭葉（粉）T/HIFSA0004斑蘭粉T/HIFSA0005斑蘭漿3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1斑蘭葉pandanleaf斑蘭葉,學(xué)名香露兜葉，采自人工種植的露兜樹(shù)科露兜樹(shù)屬植物香露兜（PandanusamaryllifoliusRoxb）的葉片，經(jīng)挑選、清洗或挑選、清洗、干燥而成。3.2斑蘭烘干粉pandanleafdryingpowder以人工種植的斑蘭葉為主要原料，經(jīng)預(yù)處理、打漿、提取、離心或不離心、過(guò)濾或不過(guò)濾、烘干、粉碎、包裝等工藝制成的粉末。3.3斑蘭凍干粉pandanleaffreeze-driedpowder以人工種植的斑蘭葉為主要原料，經(jīng)預(yù)處理、打漿、提取、離心或不離心、過(guò)濾或不過(guò)濾、低溫真空干燥、粉碎、包裝等工藝制成的粉末。3.4斑蘭速溶粉pandanleafinstantpowder以人工種植的斑蘭葉為主要原料，經(jīng)預(yù)處理、打漿、提取、離心或不離心、過(guò)濾或不過(guò)濾、真空干燥、粉碎、噴霧干燥、包裝等工藝制成的粉末。23.5斑蘭漿pandansyrup以人工種植的香露兜（PandanusamaryllifoliusRoxb）葉（斑蘭葉）鮮葉為主要原料，經(jīng)預(yù)處理、榨汁、過(guò)濾或不過(guò)濾，添加或不添加適量的添加劑，經(jīng)殺菌或不殺菌、灌裝、速凍等生產(chǎn)工藝制成的勻漿。3.6斑蘭制品以斑蘭為輔料，經(jīng)相應(yīng)工藝加工制成的產(chǎn)品。第一法氣相色譜法4原理樣品經(jīng)過(guò)氫氧化鉀-乙醇溶液皂化后，其中的角鯊烯用正己烷提取，采用氣相色譜法測(cè)定，外標(biāo)法定量。5試劑與材料除另有說(shuō)明，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1試劑5.1.1氫氧化鉀。5.1.2無(wú)水乙醇。5.1.3正己烷：色譜純。5.2試劑配制氫氧化鉀-乙醇溶液（約2mol/L）:準(zhǔn)確稱(chēng)?。?12±0.1）g氫氧化鉀，加入200mL的無(wú)水乙醇（5.1.2進(jìn)行溶解，然后用無(wú)水乙醇（5.1.2）稀釋定容至1000mL。5.3標(biāo)準(zhǔn)品角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98.0%。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.4.1角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.00mg/mL）:準(zhǔn)確稱(chēng)取按其純度折算為100%質(zhì)量的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品（5.3）100mg(精確至0.1mg)，加正己烷溶解并置于100mL棕色容量瓶（6.7）中，定容至刻度，搖勻，得到濃度為1.00mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液可于4℃條件下避光保存3個(gè)月。5.4.2角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)中間液（100μg/mL）:準(zhǔn)確吸取1.00mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.4.1）于10mL棕色容量瓶（6.7）中，用正己烷定容至刻度，混勻備用。5.4.3角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別吸取適量角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)中間液（5.4.2），用正己烷稀釋?zhuān)箻?biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度分別為10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL。6儀器和設(shè)備6.1氣相色譜儀：配氫火焰離子檢測(cè)器（FID）。6.2分析天平：精度0.0001g。6.3渦旋振蕩器。36.4恒溫水浴鍋。6.5離心機(jī)。6.6氮吹儀。6.7棕色容量瓶：10mL。6.8微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)系。6.9離心管：15mL。6.10玻璃試管:10mL。6.11組織搗碎機(jī)。6.12超聲儀。7試樣制備7.1斑蘭葉和斑蘭制品取一定數(shù)量的具有代表性的樣品，用組織搗碎機(jī)（6.11）粉碎，樣品充分混合均勻后，備用。7.2斑蘭粉和斑蘭漿取一定數(shù)量的具有代表性的樣品，充分混合均勻后，備用。8分析步驟8.1稱(chēng)樣準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2g（精確至0.0001g）試樣，置15mL離心管（6.9）中。8.2角鯊烯的提取于裝有試樣的離心管中加入2mL氫氧化鉀-乙醇溶液（5.2），置超聲儀（6.12）超聲皂化30min（在75℃條件下）后，取出離心管，冷卻至室溫；加入2mL水、1mL正己烷（5.1.3）提取，離心管至渦旋振蕩器（6.3）混勻5min，充分提??；5000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至10mL玻璃試管（6.10）中。再用1mL正己烷（5.1.3）重復(fù)提取操作3次，并將4次提取的上清液合并至10mL玻璃試管（6.10）中，置于渦旋振蕩器中混勻，用氮吹儀（6.6）吹干，立即加入1mL正己烷（5.1.3）復(fù)溶，振搖1min，過(guò)0.22μm濾膜上機(jī)。8.3氣相色譜參考條件8.3.1色譜柱：HP-5毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）色譜柱，或等效色譜柱。8.3.2進(jìn)樣口溫度：280℃。8.3.3升溫程序：160℃保持1min，以15℃/min速率升至220℃保持2min，以5℃/min速率升至280℃保持22min。8.3.4載氣：高純氮?dú)猓兌?9.999%），流速1.0mL/min，分流比4:1。8.3.5FID檢測(cè)器溫度：280℃,氫氣流速40mL/min，空氣流速300mL/min，尾吹氣（N2）30mL/min。8.3.6進(jìn)樣量：1μL。8.3.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液（5.4.3）依次按上述推薦色譜條件上機(jī)測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。48.4試樣溶液的測(cè)定在上述色譜條件下測(cè)得樣品溶液中角鯊烯的保留時(shí)間，與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間比較定性，以色譜峰峰面積定量。8.4.1空白試驗(yàn)除不加試樣外，均按上述步驟進(jìn)行操作。9結(jié)果計(jì)算樣品中角鯊烯含量按式（1）計(jì)算： 式中：X—試樣中角鯊烯的含量，單位為毫克每千克（mg/kgc—試樣提取液中角鯊烯的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLc0—空白溶液中角鯊烯的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLv—試樣提取液體積，單位為毫升（mLm—樣品稱(chēng)樣量，單位為克（gf—稀釋倍數(shù)。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。10精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。第二法氣相色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）11原理樣品經(jīng)過(guò)氫氧化鉀-乙醇溶液皂化后，其中的角鯊烯用正己烷提取，采用氣相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。12試劑與材料除另有說(shuō)明，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。12.1.1試劑12.1.2試劑配制12.1.3標(biāo)準(zhǔn)品角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98.0%。12.1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制12.1.5角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.00mg/mL）:準(zhǔn)確稱(chēng)取按其純度折算為100%質(zhì)量的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品（12.3）100mg(精確至0.1mg)，加正己烷溶解并置于100mL棕色容量瓶（13.7）中，定容至刻度，搖勻，得到濃度為1.00mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液可于4℃條件下避光保存3個(gè)月。12.1.6角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)中間液（100μg/mL）:準(zhǔn)確吸取1.00mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（12.4.1）于10mL棕色5容量瓶（13.7）中，用正己烷定容至刻度，混勻備用。12.1.7角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別吸取適量角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)中間液（12.4.2），用正己烷稀釋?zhuān)箻?biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度分別為0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL。13儀器和設(shè)備13.1氣相色譜-質(zhì)譜儀：配有電子轟擊電離源（EI）。13.2分析天平：精度0.0001g。13.3渦旋振蕩器。13.4恒溫水浴鍋。13.5離心機(jī)。13.6氮吹儀。13.7棕色容量瓶：10mL。13.8微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)系。13.9離心管：15mL。13.10玻璃試管:10mL。13.11組織搗碎機(jī)。13.12超聲儀。14試樣制備同第一法7。15分析步驟15.1稱(chēng)樣15.2角鯊烯的提取同第一法8.2。15.3氣相色譜參考條件15.3.1色譜柱：HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）色譜柱，或等效色譜柱。15.3.2進(jìn)樣口溫度：280℃。15.3.3升溫程序：180℃保持1min，以3℃/min升至280℃保持15min。15.3.4載氣：高純氮?dú)猓兌?9.999%），流速：1.0mL/min。15.3.5進(jìn)樣方式：分流，分流比50:1。15.3.6進(jìn)樣量：1.0μL。15.4質(zhì)譜參考條件15.4.1質(zhì)譜儀：質(zhì)譜檢測(cè)器（配置電子轟擊離子源）。15.4.2離子源：電子轟擊離子源（EI）。615.4.3GC-MS接口溫度：280℃。15.4.4離子源溫度：230℃。15.4.5進(jìn)樣口溫度：280℃。15.4.6EI離子源：70eV。15.4.7檢測(cè)方式：選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式：定性離子為m/z69、81、95、137，定量離子為m/z69。15.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液（12.4.3）分別注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，測(cè)定相應(yīng)的角鯊烯的色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。15.6試樣溶液的測(cè)定將試樣溶液分別注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，得到相應(yīng)的角鯊烯的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中角鯊烯的濃度。15.7定性測(cè)定將角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液（12.4.3）和樣品溶液依次按上述推薦氣相色譜-質(zhì)譜條件上機(jī)測(cè)定，在相同試驗(yàn)條件下，待測(cè)物在樣品中的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作液中的保留時(shí)間，并且色譜圖中各組分定性例子對(duì)的相對(duì)豐度與濃度接近標(biāo)準(zhǔn)工作液中相應(yīng)定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，在偏差范圍內(nèi)，則可判斷為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。角鯊烯的GC/MS色譜圖和選擇離子質(zhì)譜圖見(jiàn)附錄A.1和A.2。15.8空白試驗(yàn)除不加試樣外，均按上述步驟進(jìn)行操作。15.9結(jié)果計(jì)算樣品中角鯊烯含量按式（2）計(jì)算：式中：X—試樣中角鯊烯的含量，單位為毫克每千克（mg/kgc—試樣提取液中角鯊烯的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLc0—空白溶液中角鯊烯的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLv—試樣提取液體積，單位為毫升（mLm—樣品稱(chēng)樣量，單位為克（gf—稀釋倍數(shù)。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。15.10精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。第三法高效液相色譜法（HPLC）16原理樣品經(jīng)過(guò)氫氧化鉀-乙醇溶液皂化后，其中的角鯊烯用正己烷提取，采用高效液相色譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。17試劑與材料7除另有說(shuō)明，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。17.1試劑17.1.1氫氧化鉀。17.1.2無(wú)水乙醇。17.1.3乙腈：色譜純。17.1.4叔丁基甲醚：色譜純。17.1.5正己烷：色譜純。17.2試劑配制進(jìn)行溶解，然后用無(wú)水乙醇（17.1.2）稀釋定容至1000mL。17.3標(biāo)準(zhǔn)品角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98.0%。17.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.00mg/mL）:準(zhǔn)確稱(chēng)取按其純度折算為100%質(zhì)量的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品（17.3）100mg(精確至0.1mg)，加正己烷溶解并置于100mL棕色容量瓶（18.7）中，定容至刻度，搖勻，得到濃度為1.00mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液可于4℃條件下避光保存3個(gè)月。17.4.1角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)中間液（100μg/mL）:準(zhǔn)確吸取1.00mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（17.4.1）于10mL棕色容量瓶（18.7）中，用正己烷定容至刻度，混勻備用。17.4.2角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別吸取適量角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液（17.4.1）或角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)中間液（17.4.2用正己烷稀釋?zhuān)箻?biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度分別為10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100μ400μg/mL。17.4.3角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別吸取適量角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液（17.4.1）或角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)中間液（17.4.2用正己烷稀釋?zhuān)箻?biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度分別為10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100μ400μg/mL。18儀器和設(shè)備18.1高效液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器。18.2分析天平：精度0.0001g。18.3渦旋振蕩器。18.4恒溫水浴鍋。18.5離心機(jī)。18.6氮吹儀。18.7棕色容量瓶：10mL。18.8微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)系。18.9離心管：15mL。18.10玻璃試管:10mL。18.11組織搗碎機(jī)。18.12超聲儀。19試樣制備8同第一法7。20分析步驟20.1稱(chēng)樣20.2角鯊烯的提取同第一法8.2。20.3液相色譜測(cè)定條件20.3.1色譜柱：C18柱（250mm×4.6μm，5μm），或相當(dāng)者；20.3.2流動(dòng)相：乙腈/叔丁基甲醚（75+25，體積比）；20.3.3流速：1.0mL/min；20.3.4柱溫：35℃;20.3.5檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；20.3.6進(jìn)樣量：10μL。20.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液（17.4.3）依次按上述推薦色譜條件上機(jī)測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。20.5試樣溶液的測(cè)定在上述色譜條件下測(cè)得樣品溶液中角鯊烯的保留時(shí)間，與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間比較定性，以色譜峰峰面積定量。21結(jié)果計(jì)算樣品中角鯊烯含量按式（3）計(jì)算：式中：X—試樣中角鯊烯的含量，單位為毫克每千克（mg/kgc—試樣提取液中角鯊烯的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLv—試樣提取液體積，單位為毫升（mLm—樣品稱(chēng)樣量，單位為克（gf—稀釋倍數(shù)。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。22精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。RelativeAbundanceRelativeAbundance附錄B（規(guī)范性）附錄C色譜圖和質(zhì)譜圖A.1角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的GC/MS色譜圖見(jiàn)圖A.1。 2.45E8 2.45E8656045402520