JIP3基因敲除對(duì)NAFLD小鼠肝損傷的作用及機(jī)制研究

JIP3基因敲除對(duì)NAFLD小鼠肝損傷的作用及機(jī)制研究背景肥胖相關(guān)代謝性疾病,包括非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）,糖尿病和冠心病等患病率逐年上升,目前的治療措施主要針對(duì)疾病的后果而不是代謝紊亂的原因。因此,探討肥胖相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制對(duì)于臨床預(yù)防和治療肥胖及相關(guān)代謝性疾病有很重要的指導(dǎo)意義。NAFLD是指除酒精及其他明確肝損害因素所致的肝脂肪變性及脂代謝紊亂。NAFLD發(fā)病的始動(dòng)因素與肥胖和胰島素抵抗密切相關(guān),脂肪堆積在肝臟易引發(fā)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化,從而誘發(fā)肝細(xì)胞損傷、炎癥及纖維化,促進(jìn)NAFLD進(jìn)展。JNK相互作用蛋白3（JIP3）是JIP家族的一員,最初被認(rèn)為是c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)通路支架蛋白。JIP3具有較強(qiáng)的形成異二聚體的能力,多面JIP3支架蛋白可以和Toll樣受體（TLR）相關(guān)聯(lián),TLR識(shí)別病原體特異性分子基序進(jìn)而參與NF-κB和MAPK信號(hào)途徑（包括ERK1/2和JNK等）的傳導(dǎo),參與細(xì)胞增殖、凋亡、神經(jīng)元發(fā)育、遞質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬砘顒?dòng)。目前關(guān)于JIP3的研究主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng),其是否可通過(guò)調(diào)控NF-κB和MAPK信號(hào)通路影響NAFLD肝損傷和脂代謝目前尚不清楚。目的本研究的目的是以JIP3基因敲除小鼠(JIP3^-/-小鼠)為研究對(duì)象,通過(guò)高脂飲食建立NAFLD模型,探討JIP3對(duì)NAFLD小鼠肝損傷的作用及分子機(jī)制。方法將6-8周齡重18-20g的雄性小鼠(野生型和JIP3^-/-型)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分成4組（n=12/組）:（1）正常飲食野生型組（WT/Con）;（2）正常飲食JIP3^-/-組(JIP3^-/-/Con);（3）高脂飲食野生型組（WT/HFD）;（4）高脂飲食JIP3^-/-組(JIP3^-/-/HFD)?？傦曫B(yǎng)時(shí)間為16周,飼養(yǎng)期間每周測(cè)量小鼠體重和血糖。12周時(shí),各組均隨機(jī)取出4只進(jìn)行血脂測(cè)定和HE染色,評(píng)估NAFLD模型建立是否成功。16周末,禁食12h后進(jìn)行IPGTT和IPITT。次日,小鼠麻醉狀態(tài)下通過(guò)雙能X射線吸收測(cè)定法評(píng)估體脂含量,取肝組織保存在液氮中。培養(yǎng)AML-12細(xì)胞,將JIP3siRNA轉(zhuǎn)染至AML-12細(xì)胞,將細(xì)胞分為四組:（1）正常對(duì)照組（con）;（2）高果糖組（HFr）;（3）高果糖JIP3沉默組（siJIP3）;（4）siRNA對(duì)照組（siNC）。取靜脈血行生化、激素檢測(cè);WesternBlot檢測(cè)肝臟組織或細(xì)胞p-NF-κB、p-JNK等蛋白的表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-18和COX2表達(dá);DCF分析ROS生成及定量測(cè)量H₂O₂、MDA、XO、SOD及TAC;小鼠肝臟組織甲醛固定后行HE染色觀察形態(tài)學(xué)變化;免疫組化、免疫熒光檢測(cè)p-NF-κB、p-JNK蛋白的表達(dá)及定位。結(jié)果1.JIP3基因敲除改善高脂飲食小鼠的代謝紊亂和肝損傷與正常飲食組相比,HFD組小鼠體重、體脂含量顯著增加,空腹血糖及胰島素水平明顯升高,IPGTT及IPITT結(jié)果提示,小鼠糖耐量受損,胰島素抵抗明顯;JIP3基因敲除后,小鼠體重及脂肪含量降低,空腹血糖及胰島素敏感性改善。HFD組小鼠肝臟脂肪變性、血清ALT、AST及血脂水平明顯升高,肝臟組織中TC和TG含量明顯增加,而JIP3基因敲除小鼠上述肝損傷及脂肪變性指標(biāo)均有所改善。2.JIP3基因敲除改善高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)與正常飲食組相比,HFD組小鼠血清及肝臟組織中炎癥因子（IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-18和COX2）表達(dá)均上調(diào),氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)（ROS,H₂O₂,O₂^-,MDA,XO,iNOS）表達(dá)水平增加,抗氧化因子（SOD,TAC）水平下降。JIP3基因敲除后,小鼠炎癥因子水平降低,抗氧化應(yīng)激因子水平升高,氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)下調(diào)。3.JIP3敲除影響脂代謝、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制JIP3基因敲除下調(diào)脂質(zhì)生成相關(guān)基因的表達(dá),包括SREBP1c,FAS,SCD1,ADFP和ChREBPα。Westernblot顯示HFD誘導(dǎo)氧化應(yīng)激相關(guān)基因TXNIP,NLRP3,ASC和Caspase-1表達(dá)上調(diào),而JIP3敲除小鼠中上述基因表達(dá)降低。與WT/Con小鼠相比,JIP3^-/-/HFD小鼠肝臟組織抗氧化因子HO-1和Nrf-2表達(dá)顯著上調(diào),同時(shí),TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄活性下降。4.JIP3下調(diào)可改善高果糖誘導(dǎo)的AML-12細(xì)胞的脂質(zhì)合成、氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因（SREBP1c,FAS,SCD1,FDAP和ChREBPα）在HFr培養(yǎng)的AML-12細(xì)胞中高表達(dá),JIP3沉默后上述基因表達(dá)下調(diào)。HFr組TXNIP,NLRP3,ASC和Caspase-1表達(dá)增加,JIP3沉默組顯著降低。與HFr組相比,JIP3沉默組細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷因子ROS,H₂O₂,O₂^-,MDA,XO,iNOS水平顯著降低,相反,抗氧化因子SOD和TAC