幾丁寡糖對(duì)脂肪酸代謝紊亂的抑制作用及分子機(jī)制研究

幾丁寡糖對(duì)脂肪酸代謝紊亂的抑制作用及分子機(jī)制研究目的:探討幾丁寡糖(Chitinoligosaccharide,NACOS)對(duì)機(jī)體脂代謝紊亂的抑制作用及其潛在的分子機(jī)制。方法:體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn):(1)MTT法篩選用藥濃度:分別采用濃度梯度的PA(0、25、50、100和200μM)預(yù)先作用24h,MTT法用酶標(biāo)儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖的OD值,計(jì)算細(xì)胞存活率,判斷最適PA濃度。將HepG2細(xì)胞經(jīng)NACOS(0、50、100μg/ml)預(yù)處理12h后,加入PA處理24h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,判斷最適NACOS濃度。(2)油紅O染色法:HepG2細(xì)胞經(jīng)NACOS(0、50、100μg/ml)預(yù)處理12h后,再用PA刺激24h。倒置顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué),以此評(píng)價(jià)NACOS對(duì)PA誘導(dǎo)所致的HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)沉淀的影響以及NACOSA抑制HepG2細(xì)胞活化的最適濃度。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)檢測(cè)HepG2細(xì)胞經(jīng)PA刺激不同時(shí)間后過氧化物酶體增殖體受體共激活因子-1α(PGC1α)、炎癥因子IL-1β、乙酰輔酶A1(ACC1)、細(xì)胞色素氧化酶亞單位-5b(Cox5b)、中鏈?；o酶A脫氧酶(Mcad)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,以評(píng)價(jià)PA對(duì)HepG2細(xì)胞的最適處理時(shí)間;將HepG2細(xì)胞經(jīng)NACOS(100μg/mL)預(yù)處理12h后,加入PA處理24h,檢測(cè)過PGC1α、Il-1β、ACC1、Cox5b、Mcad的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,以評(píng)價(jià)NACOS對(duì)PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂代謝紊亂的抑制作用。(4)免疫印跡法(WesternbLot)檢測(cè)HepG2細(xì)胞經(jīng)PA不同時(shí)間刺激后MAPKs及PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白激酶p-p38、ERK1/2、Akt的蛋白磷酸化水平的變化,以評(píng)價(jià)PA對(duì)HepG2細(xì)胞的最適處理時(shí)間;將HepG2細(xì)胞經(jīng)NACOS(0、50、100μg/ml)預(yù)處理12h后,再用PA刺激0.5h,檢測(cè)MAPKs及PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白激酶p-p38、p-ERK1/2、p-Akt的蛋白水平的變化,以評(píng)價(jià)NACOS對(duì)PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂代謝紊亂的抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組(n=5),即正常對(duì)照(normalcontrolgroup,NCD)組、高脂飲食(highfatdiet,HFD)組、NACOS組、NACOS+HFD組,造模20周,乙醚麻醉殺死小鼠,提取肝臟組織進(jìn)行檢查,用于制備組織勻漿。主要檢測(cè)方法如下:(1)考察高脂模型C57BL/6小鼠在給予NACOS后各項(xiàng)生理指標(biāo)的的變化,如體重、飲水、飲食上的變化。(2)RT-PCR方法檢測(cè)肝臟組織中過氧化物酶體增殖體受體共激活因子-1α、白介素因子1-β、乙酰輔酶A1、細(xì)胞色素氧化酶亞單位-5b、中鏈?；o酶A脫氧酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的變化。(3)Westernblotting方法檢測(cè)MAPKs及PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白激酶p-p38、p-ERK1/2、p-Akt的蛋白水平的變化。結(jié)果:體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn):(1)MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)表明,PA在25-200μM范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞的活力沒有明顯的抑制作用,表明PA在該濃度下沒有細(xì)胞毒性,可在此濃度以下進(jìn)行體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn);NACOS100μg/mL可略微增加HepG2的活力,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且NACOS與PA聯(lián)合進(jìn)行藥物處理時(shí)亦沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用。(2)油紅O染色實(shí)驗(yàn)顯示,PA處理后則細(xì)胞漿中的紅色脂肪顆粒呈顯著聚集趨勢(shì)。與PA單相比,NACOS預(yù)處理可明顯抑制PA誘導(dǎo)所致的HepG2細(xì)胞中脂滴的形成。(3)RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HepG2細(xì)胞經(jīng)PA100μM處理3-24h后,PGC1α、IL-1β、ACC1、Cox5b、Mcad均表現(xiàn)出不同程度的升高(P<0.05或0.01),并在作用6h后達(dá)峰值。(4)Westernblotting結(jié)果顯示,HepG2細(xì)胞經(jīng)PA100μM刺激后,絲裂原活化蛋白激酶(Mitogenactivatedproteinkinases,MAPKs)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphoinositide3-kinase,PI3K;ProteinkinaseB,Akt)通路中的p38、ERK1/2、Akt激酶迅速激活,其磷酸化水平在0-1h內(nèi)呈時(shí)間依賴性增加。其中,p-ERK1/2及p-Akt在0.5h時(shí)達(dá)峰值(P<0.05,vs對(duì)照組),而p-p38則在1h時(shí)達(dá)最高水平(P<0.01,vs對(duì)照組)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)與給予基礎(chǔ)飼料的正常對(duì)照組(NCD)小鼠比較,高脂模型組(HFD)小鼠的平均體重顯著增加(P<0.01)。相反,當(dāng)高脂小鼠同時(shí)給予NACOS(1mg/ml)處理時(shí),可顯著抑制其體重的增加(P<0.05或0.01)。高脂飼料和或NACOS均對(duì)小鼠的采食量及飲水量沒有明顯影響。(2)RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HFD組小鼠較NCD組小鼠肝臟組織中PGC1α、ACC1及Mcad顯著升高(P<0.05或0.01),炎癥因子IL-1β亦增加明顯(P<0.05),但HFD處理對(duì)Cox5b的轉(zhuǎn)錄表達(dá)無(wú)顯著影響。與HFD組比較,小鼠經(jīng)NACOS處理后,其肝臟組織中脂代謝調(diào)控因子PGC1α、Mcad及ACC1的轉(zhuǎn)錄水平均不同程度地得到抑制(P<0.05或0.01),炎癥因子IL-1β亦顯著降低(P<0.05或0.01),Cox5b轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平變化不明顯。(3)Westernblotting結(jié)果顯示,與NCD組小鼠相比,HFD組小鼠肝臟的p-p38、p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著增高(P<0.05),而p-ERK1/2則無(wú)明顯差別。與HFD組相比,MACOS可顯著抑制高脂飲食喂養(yǎng)所致p-p38及p-Akt的激活(P<0.01或0.05)。此外,NACOS亦可降低p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論:(1)體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:NACOS與PA聯(lián)合進(jìn)行藥物處理時(shí)沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用NACOS預(yù)處理明顯抑制PA誘導(dǎo)所致的HepG2細(xì)胞中脂滴的形成;NACOS抑制PA刺激引起的HepG2細(xì)胞脂代謝的紊亂及相關(guān)炎癥因子的過表達(dá);NACOS預(yù)處理顯著抑制p-p38、p-ERK1/2及p-Akt的表達(dá)水平。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:高脂小鼠同時(shí)給予NACOS(1m