高效液相色譜分析方法的建立

關(guān)于高效液相色譜分析方法的建立反相高效液相色譜（RP-HPLC）

分析方法的建立第2頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天什么是色譜？色譜是一種建立在一定的科學(xué)理論基礎(chǔ)上的分離方法（工具、手段）。除色譜之外，經(jīng)典（常見(jiàn)）的分離方法：蒸餾、離心、電泳、過(guò)濾、沉淀、萃取等等色譜是一種高效能的分離方法色譜分析以一定的科學(xué)理論為基礎(chǔ)，在高效能的分離基礎(chǔ)上，結(jié)合先進(jìn)的檢測(cè)方法而建立的現(xiàn)代分析方法。第3頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天什么是高效液相色譜法？HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡(jiǎn)稱(chēng)：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于現(xiàn)代儀器方法的高效能分析方法：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)器……廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學(xué)/食品及農(nóng)業(yè)……在技術(shù)、理論及應(yīng)用上已進(jìn)入一個(gè)較高的水平，并高速發(fā)展。第4頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天HPLC的基本配置及流程溶劑

色譜泵手動(dòng)/自動(dòng)進(jìn)樣器

HPLC色譜柱檢測(cè)器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

第5頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天第6頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天HPLC的儀器配置泵系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)樣器色譜柱及柱溫箱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)溶劑第7頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天第9頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天第10頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天第11頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜的發(fā)明人-——茨維特（M.S.Tswett）

俄國(guó)科學(xué)家茨維特1903年利用物質(zhì)的吸附原理，開(kāi)創(chuàng)了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法。1906年正式命名色譜法；Chromatography30年代開(kāi)始廣泛研究和應(yīng)用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于70年代第12頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜的發(fā)明人俄國(guó)科學(xué)家

M.S.Tswett第13頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天正式命名“色譜”的文獻(xiàn)中的一段話(huà)第14頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天一般情況下HPLC不是分析方法的首選

分析方法選擇的大致程序（以藥典分析方法為例）：

滴定分析（原料藥、制劑定量分析）紫外可見(jiàn)光度分析（原料藥、制劑定量分析）薄層色譜（鑒別、有關(guān)物質(zhì)檢查等；半定量分析）

HPLC（中藥飲片、中藥制劑的鑒別或有關(guān)物質(zhì)的檢查；復(fù)雜樣品定量分析等）什么情況下使用HPLC？第15頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天什么情況下使用HPLC？1、對(duì)分析結(jié)果、測(cè)定速度和效率的要求準(zhǔn)確度要求：準(zhǔn)確定量（RSD<5％）測(cè)定速度和效率：快速，單一或多組分測(cè)定。2、樣品情況樣品的復(fù)雜情況：HPLC適用于復(fù)雜樣品的分析，如中藥分析、環(huán)境分析、體內(nèi)藥物分析、臨床藥物分析等。第16頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天HPLC方法建立的前期工作

樣品情況的了解：樣品的種類(lèi)（來(lái)源）：植物（中草藥）、合成中間體、生物樣品（血液、尿液、組織勻漿等）……

樣品的種類(lèi)決定了樣品的復(fù)雜程度（基質(zhì)影響），從而可初步判定測(cè)定的難易程度并且為分析方法的確立設(shè)計(jì)一個(gè)大致的方向。待測(cè)成分的性質(zhì)：極性、水溶性、脂溶性、酸堿性等對(duì)方法的建立，有重要的指導(dǎo)意義。第17頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天待測(cè)成分的結(jié)構(gòu)特征：對(duì)色譜柱的選擇具有一定的指導(dǎo)意義（不是很明顯）；對(duì)檢測(cè)器的選擇具有指導(dǎo)意義，如：含有生色團(tuán)（助色團(tuán)），紫外有吸收，特別是芳香族化合物，可考慮使用紫外檢測(cè)器待測(cè)成分的含量：

決定對(duì)柱效的要求（柱效高，可有較低的檢測(cè)限）決定對(duì)檢測(cè)器靈敏度的要求樣品情況的了解：第18頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)定成分的數(shù)量以及性質(zhì)相似程度：?jiǎn)我怀煞值臏y(cè)定，最簡(jiǎn)單，隨著測(cè)定成分的增加，分析的難度增加；組分性質(zhì)的相似程度越高，分析的難度越高。樣品情況的了解：?jiǎn)栴}：組分性質(zhì)的相差越大，分析的難度越低，是否越有利于多組分分析？第19頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天查閱有關(guān)的文獻(xiàn)資料文獻(xiàn)資料——有：在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，調(diào)整、改善。不排除在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上全面創(chuàng)新。第20頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天文獻(xiàn)查閱時(shí)應(yīng)注意的基本內(nèi)容液相色譜實(shí)驗(yàn)所需的基本參數(shù)樣品預(yù)處理方案對(duì)照品（標(biāo)準(zhǔn)品）的配制方法流動(dòng)相：種類(lèi)及配比，等度或梯度？固定相：色譜柱類(lèi)型、顆粒大小及內(nèi)徑、長(zhǎng)短流動(dòng)相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速檢測(cè)器及相應(yīng)參數(shù)：如紫外檢測(cè)波長(zhǎng)，靈敏度等溫度控制進(jìn)樣量以上參數(shù)即構(gòu)成一個(gè)具體的HPLC方法；亦稱(chēng)色譜分析條件。第21頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天查閱有關(guān)的文獻(xiàn)資料文獻(xiàn)資料——無(wú)：結(jié)合樣品的情況，首先應(yīng)作一些試探性的工作。（見(jiàn)后面）第22頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天評(píng)價(jià)高效液相色譜方法的標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題：什么樣的分離結(jié)果是好的？答：用盡可能少的時(shí)間和消耗（人力、物力、財(cái)力等）滿(mǎn)足分析的要求（準(zhǔn)確度、靈敏度、分析速度等）。只有更好，沒(méi)有最好！第23頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

理論塔板數(shù)n

：分離效率（柱效）的量度理論塔板數(shù)計(jì)算公式：評(píng)價(jià)液相色譜方法的標(biāo)準(zhǔn)理論塔板數(shù)n

：描述組分被保留的程度以及色譜峰譜帶展寬的程度。塔板數(shù)越大，柱效越高。第24頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天W=.5W=2tR=5tR與W是一對(duì)矛盾，tR/W可以很好地表達(dá)這對(duì)矛盾的情況。第25頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

影響柱效的因素很多，可以從色譜理論進(jìn)行分析，如塔板理論、速率理論等，具體內(nèi)容參見(jiàn)有關(guān)教科書(shū)或?qū)Ｖ?。?6頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天什么是色譜的分離度分離度的公式：R：分離程度的量度簡(jiǎn)稱(chēng)分離度評(píng)價(jià)液相色譜方法的標(biāo)準(zhǔn)tR1tR2第27頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天影響分離度的因素：k、α及n分離度方程：

k

是容量因子，表達(dá)了被分離組分與柱填料之間作用的強(qiáng)弱

α是分離因子，描述兩個(gè)被分離組份容量因子的相對(duì)大小。α

＝k2/k1

n是理論塔板數(shù)，描述組分被保留的程度以及色譜峰譜帶展寬的程度第28頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天分離度是色譜分離中主要考慮的因素除分離度之外，在設(shè)計(jì)色譜方法時(shí)，以下幾個(gè)因素也都要考慮：靈敏度載樣量分析速度溶劑損耗成本容易使用（簡(jiǎn)單）色譜柱壽命第29頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天文獻(xiàn)資料查詢(xún)——無(wú)根據(jù)評(píng)價(jià)液相色譜方法的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合樣品的情況，作一些試探性的工作根據(jù)評(píng)價(jià)液相色譜方法的標(biāo)準(zhǔn)，

進(jìn)行試探性工作第30頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜分析樣品預(yù)處理的主要目的將待測(cè)物質(zhì)有效地從樣品基質(zhì)中釋放出來(lái)，制成便于分析測(cè)定的穩(wěn)定液體試樣。如：中草藥或中成藥有效（指標(biāo)）成分分析；體液中藥物或代謝物含量的測(cè)定等。除去雜質(zhì)，純化樣品，防止色譜柱的堵塞。如生物樣品中的蛋白質(zhì)、葉綠素、固體微粒等。富集濃縮樣品或進(jìn)行衍生化，以達(dá)到色譜分析的檢測(cè)限。一、根據(jù)了解的樣品信息以及分析目的，建立樣品預(yù)處理方案第31頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天進(jìn)行樣品預(yù)處理的必要性

樣品只有成為液體狀態(tài)才能直接進(jìn)行HPLC分析。雖然色譜分析具有很強(qiáng)的處理復(fù)雜樣品的能力，但樣品如果過(guò)于復(fù)雜（如中藥飲片、中成藥、生物樣品分析等），若不進(jìn)行必要的預(yù)處理，則會(huì)影響到分析的準(zhǔn)確性，并且可能導(dǎo)致測(cè)定失敗。任何先進(jìn)的色譜技術(shù)都須有先進(jìn)的樣品處理技術(shù)相匹配，樣品處理技術(shù)的適當(dāng)與否，直接關(guān)系到色譜分析的成本、速度和實(shí)用性。第32頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天樣品預(yù)處理的種類(lèi)物理的分離與濃縮技術(shù)

過(guò)濾、沉淀分離、吸附、蒸餾、溶劑的揮發(fā)溶劑萃取回流、索氏提取、超聲波提取固相萃取（SPE）

吸附劑（硅膠、氧化鋁）、高分子大孔樹(shù)脂（苯乙烯－二乙烯苯）、離子交換樹(shù)脂、鍵合硅膠等超臨界流體萃取化學(xué)衍生化技術(shù)第33頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天HPLC檢測(cè)器應(yīng)提供的功能對(duì)樣品有響應(yīng)，并有一個(gè)輸出信號(hào)檢測(cè)器響應(yīng)值與樣品濃度之間在一定的濃度范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系二、選擇檢測(cè)器、確定使用條件第34頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天HPLC檢測(cè)器可以分為：溶質(zhì)性質(zhì)檢測(cè)器（Solutepropertydetectors）對(duì)溶質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，一般不反映流動(dòng)相的變化（選擇型）整體性質(zhì)檢測(cè)器（Bulkpropertydetectors）不管是否有溶質(zhì)，對(duì)流動(dòng)相任何物理性質(zhì)的變化作出響應(yīng)（通用型）

沒(méi)有任何一種單獨(dú)的檢測(cè)器可以適應(yīng)所有的液相色譜分離！第35頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同種類(lèi)的檢測(cè)器的分類(lèi)整體性質(zhì)示差折光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器溶質(zhì)性質(zhì)熒光檢測(cè)器固定波長(zhǎng)可變波長(zhǎng)光電二極管矩陣電化學(xué)檢測(cè)器放射化學(xué)檢測(cè)器氮/硫檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器第36頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天理想的HPLC檢測(cè)器高靈敏度；可忽略基線(xiàn)噪音（信噪比高）寬的線(xiàn)性范圍獨(dú)立于流動(dòng)相及操作參數(shù)的響應(yīng)對(duì)流動(dòng)相的壓力、溫度及流速等變化不敏感長(zhǎng)時(shí)間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性（可降低分析組分色譜分離的壓力）第37頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天檢測(cè)器的靈敏度：信噪比靈敏度是信號(hào)與噪音的比值；即峰高與基線(xiàn)噪音的比值（S/N）檢測(cè)限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10高的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更準(zhǔn)確的定量更好地完成色譜峰純度的確認(rèn) （較低的閾值）6:1NS第38頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用液相色譜的檢測(cè)器常規(guī)檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器（RefractiveIndex）紫外/可見(jiàn)光吸收檢測(cè)器（UV-Vis）熒光檢測(cè)器（Fluorescence）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（EvaporativeLightScattering）其他檢測(cè)器（OtherDetectors）高端檢測(cè)器光電二極管矩陣檢測(cè)器（PhotodiodeArrayPDA）質(zhì)譜檢測(cè)器（MassSpectrometry）第39頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天選擇液相色譜的檢測(cè)器要考慮的因素：

你要分離的化合物/樣品的化學(xué)特性化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等等流動(dòng)相的影響溶劑、緩沖鹽、改性劑等梯度還是等度（梯度不適于整體性質(zhì)檢測(cè)器）準(zhǔn)確度要求靈敏度需求是否有雙檢測(cè)的需求第40頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天HPLC檢測(cè)器的選擇：通用檢測(cè)器 RIELSD MS靈敏度 mg ng pg 線(xiàn)性范圍 104

否 103流速敏感 是 否 是溫度敏感 是 是 是破壞性 否 是 是選擇性檢測(cè)器UV/Vis

FL EC MS靈敏度 ng pg fg pg線(xiàn)性范圍 105 103 106 103流速敏感 否 否 是 是溫度敏感 否 否 是 是破壞性 否 否 是 是第41頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天UV/Vis檢測(cè)器目前實(shí)驗(yàn)室中最流行的選擇約75%的HPLC檢測(cè)器配備的是UV/Vis（其中50%是可變波長(zhǎng)，25%是PDA）吸光度與樣品濃度呈線(xiàn)性關(guān)系在被測(cè)物的最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)時(shí)靈敏度最大第42頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天UV/Vis的優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實(shí)驗(yàn)并且是非破壞性的大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度一般來(lái)說(shuō)靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)色譜圖第43頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天UV/Vis的缺點(diǎn)由于不是所有化合物都有紫外可見(jiàn)吸收，因此不是通用檢測(cè)器（有時(shí)也是優(yōu)點(diǎn)）對(duì)某些化合物的檢測(cè)靈敏度不及其他檢測(cè)器樣品中不同化合物的最大吸收波長(zhǎng)不同時(shí)，需要使用多波長(zhǎng)檢測(cè)，或使用折衷的波長(zhǎng)受流動(dòng)相組成的影響：用截止波長(zhǎng)以上至少5～10nm作為工作波長(zhǎng)緩沖鹽、離子對(duì)試劑、胺改性劑（抑制拖尾）也會(huì)有影響第44頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天背景吸收的影響背景吸收降低了線(xiàn)性范圍多數(shù)流動(dòng)相有背景紫外吸收實(shí)際濃度理想10吸光度210背景吸收第45頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光（Fluorescence）檢測(cè)器發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子達(dá)到激發(fā)態(tài)，其返回到基態(tài)時(shí)發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光?；鶓B(tài)激發(fā)態(tài)S1S0激發(fā)（1）振動(dòng)能（2）發(fā)射（3）1.分子在吸收UV或可見(jiàn)光后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，分子達(dá)到不穩(wěn)定的高能量狀態(tài)。2.電子失去過(guò)剩的能量成為振動(dòng)能，并達(dá)到最低的激發(fā)單重態(tài)。3.電子失去能量達(dá)到基態(tài)時(shí)發(fā)出熒光共軛及芳香族化合物最容易有熒光現(xiàn)象第46頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光檢測(cè)器原理第47頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光檢測(cè)器的應(yīng)用環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、飲料食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸生物技術(shù)及制藥黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）維生素第48頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)選擇性提高靈敏度提高（在pg/fg范圍）低背景技術(shù)mV-0.100.000.100.200.300.400.50Minutes5.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.006.8949.639MDA及MDMA柱上200pgExcitation

=280Emission=360第49頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光檢測(cè)器的缺點(diǎn)不是所有化合物都有熒光，需要衍生；檢測(cè)器對(duì)溶解氣體及其他淬滅物質(zhì)（如甲醇）敏感；Ex及Em的最佳，易受溫度、溶劑的極性和粘度、溶劑的pH值及樣品濃度影響；多數(shù)儀器的批次間差異較大，同一型號(hào)的不同熒光檢測(cè)器會(huì)得到不同的結(jié)果。第50頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天溶劑中溶解的氣體對(duì)響應(yīng)值的影響實(shí)例MinutesColumn-PAHColumn@27oCEluentA:WaterEluentB:AcetonitrileGradient:60%Bto100%Busingcurve9in12minutesHold11minutesBacktoinitialconditionsFlowRate1.2ml/minInjection:20ulTimeprogrammedwavelengthchanges20.521.022.01000MV充分脫氣未充分脫氣FluorescenceDetector1231.Benzo(b)flouranthene-400ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200ppb3.Benzo(a)pyrene-200ppb第51頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天蒸發(fā)光散射（EvaporativeLightScattering）檢測(cè)器用氮?dú)獍蚜鲃?dòng)相吹成細(xì)霧狀液滴；流動(dòng)相的液滴通過(guò)一個(gè)預(yù)加熱的腔體后被蒸發(fā)掉；蒸發(fā)的溶劑被除去；溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動(dòng)相，因此產(chǎn)生顆粒束并與入射光相交，產(chǎn)生散射；散射光在光電倍增管（PMT）上產(chǎn)生信號(hào)；PMT的輸出與溶質(zhì)的量呈比

例關(guān)系第52頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天蒸發(fā)光散射檢測(cè)器原理示意圖EvaporativeLightScattering簡(jiǎn)稱(chēng)：ELSD入射光樣品顆粒散射光光電倍增管第53頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天ELSD－優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用領(lǐng)域通用型檢測(cè)器：一般情況下，比流動(dòng)相揮發(fā)性小的且能產(chǎn)生顆粒的物質(zhì)都能被檢測(cè)可以作梯度洗脫；檢測(cè)下限可到納克級(jí)水平對(duì)環(huán)境條件不敏感；可以使用有強(qiáng)紫外吸收的溶劑作流動(dòng)相應(yīng)用領(lǐng)域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制藥行業(yè)表面活性劑天然產(chǎn)物第54頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天ELSD－缺點(diǎn)不能使用含不揮發(fā)性成分的流動(dòng)相（例如：磷酸鹽）；要求使用霧化氣源（一般是氮?dú)?，也可使用壓縮空氣）；當(dāng)色譜條件改變時(shí)，霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化；破壞性技術(shù)；蒸發(fā)出的溶劑要排到室外；對(duì)揮發(fā)性化合物的檢測(cè)不理想，（不出峰）；一般得到的是非線(xiàn)性校正曲線(xiàn)；某些化合物的檢測(cè)靈敏度不如其他檢測(cè)器第55頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天光電二極管矩陣（PhotoDiodeArray）檢測(cè)器PhotoDiodeArray簡(jiǎn)稱(chēng)：PDA或DAD(DiodeArraydetector)入射光流通池光柵光電二極管矩陣第56頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天PDA檢測(cè)器－特點(diǎn)三維水平的吸光度檢測(cè)器二極管矩陣檢測(cè)器是在1982年首度出現(xiàn)的需要相應(yīng)的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析第57頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天PDA檢測(cè)器的用途及要求光電二極管檢測(cè)器可以提供許多有用的功能光譜信息色譜峰純度譜庫(kù)擬合像其他所有的UV/Vis檢測(cè)器一樣，需要：高的信噪比；好的線(xiàn)性另外；還需要：光學(xué)分辨率光譜靈敏度及光譜分析軟件第58頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天PDA的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)好的選擇性、線(xiàn)性提供色譜峰的UV/Vis光譜圖（峰確認(rèn)）可提供純度估計(jì)（有限度的）缺點(diǎn)靈敏度略低于V/Vis檢測(cè)器第59頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天質(zhì)譜（MassSpectrometryMS）檢測(cè)器m/z+/-MS： 是一種按照分子量及其電荷分離物質(zhì)的技術(shù)，經(jīng)過(guò)多年的不斷開(kāi)發(fā)及改進(jìn)，已經(jīng)使質(zhì)譜成為一種多功能、高靈敏度，并被越來(lái)越廣泛使用的分析技術(shù)。LC/MS：液相色譜與質(zhì)譜的連用。需要： 除去HPLC的溶劑；產(chǎn)生離子；分離離子；檢測(cè)離子；計(jì)算離子強(qiáng)度；處理數(shù)據(jù)。第60頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜分離中的四種情況如圖所示：④完全分離，柱效高，選擇性（

）好。①分離效果差，柱效低，選擇性（

）低；②完全分離，柱效高，峰窄，選擇性（

）低；③完全分離，選擇性（

）增加，柱效低，峰寬；三、

色譜分離度及其分離條件的選擇1

色譜分離方程式第61頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

假設(shè)兩組分的塔板數(shù)相等，k平均=(k1+k2)/2。因此可導(dǎo)出R與n、和

k

的關(guān)系：分離方程式同時(shí)反映了色譜柱效能n和選擇性α（ri,s相對(duì)保留值）以及容量因子k對(duì)分離度的影響，是一個(gè)綜合指標(biāo)。n為理論塔板數(shù)；k2為色譜圖上相鄰兩組分中第二組分的容量因子；k平均可用k2代替；α為分配系數(shù)比，α＝K2/K1=k2/k1。分離方程式第62頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天（有關(guān)色譜方程式的討論）(1)分離度R與柱效的關(guān)系分離度R與理論塔板數(shù)n有關(guān)。由色譜分離方程式可得：

因此可通過(guò)增加柱長(zhǎng)提高分離度。然而，分析時(shí)間也相應(yīng)增加，且峰寬也展寬！為提高柱效，用減小塔板高度H的方法比增加柱長(zhǎng)更有效。2提高分離度的方法第63頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)分離度R與分配系數(shù)比

的關(guān)系

越大，柱選擇性越好，對(duì)分離有利。

的微小變化可引起R較大改變。如，當(dāng)

從1.01增加至1.10(增加9%)時(shí)，R則增加9倍(但>1.5,R增加不大)

。改變

的方法有：降低柱溫、改變流動(dòng)相及固定相的性質(zhì)和組成。(3)分離度R與容量因子k的關(guān)系

k增加，分離度R增加，但分析時(shí)間也將增加。當(dāng)k>10，則R的增加不明顯。通常k控制在1~10之間。最好1~5。改變k的方法有：適當(dāng)增加柱溫、改變流動(dòng)相性質(zhì)以及固定液膜厚度。第64頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天容量因子（k）、柱效（H）及分配系數(shù)比（α）對(duì)分離度（R）的影響HH第65頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天3

分離條件選擇的基本依據(jù)在分離多組分復(fù)雜混合物時(shí)，分子量相近、沸點(diǎn)差小及極性相似的組分，保留值相差小，分離較難。有必要設(shè)立一個(gè)指標(biāo)，表征這種難分離的物質(zhì)對(duì)。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)對(duì)分離的影響，設(shè)立Sd值作為難分離物質(zhì)對(duì)的量度。在一定的色譜條件下，規(guī)定：k1、k2為容量因子，β*為動(dòng)力學(xué)系數(shù)(1)難分離物質(zhì)對(duì)的預(yù)測(cè)k2/k1比值越小，β*越大，Sd值就越小，分離越難。k2/k1屬于熱力學(xué)參數(shù)，β*屬于動(dòng)力學(xué)參數(shù)。如溫度如流速第66頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)分離度的確定分離度的確定，應(yīng)根據(jù)樣品的復(fù)雜程度、分離的難易程度、誤差要求等作出選擇。對(duì)一個(gè)分離來(lái)說(shuō)，并不是分離度越高越好，換句話(huà)：夠用、且誤差符合要求即可。分離度較低，但可用逢高定量，誤差符合要求。分離度適中，有誤差，但是誤差<5%。第67頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)流動(dòng)相線(xiàn)速度的選擇根據(jù)Vandeemter方程式有一個(gè)最佳流速，也就是H值最小時(shí)的流動(dòng)相流速。但是由于這個(gè)流速一般較小，考慮到分析效率，有時(shí)會(huì)犧牲柱效而提高流速。(4)色譜柱溫度的選擇（主要適用于氣相色譜）在保證最難分離的物質(zhì)對(duì)達(dá)到預(yù)期的分離前提下，柱溫越高越好，可以縮短組分流出色譜柱的時(shí)間，提高工作效率，但是應(yīng)特別注意儀器和固定相所能承受的溫度最高限度。(5)進(jìn)樣量選擇考慮到色譜柱的容量、組分在流動(dòng)相中的溶解度以及檢測(cè)器的靈敏度及線(xiàn)性范圍，所以，在保證達(dá)到檢測(cè)器靈敏度的前提條件下，采用盡可能小的進(jìn)樣量。(6)其他分離的選擇如柱長(zhǎng)、流動(dòng)相種類(lèi)和組成、固定相、梯度洗脫、程序升溫等等，參見(jiàn)后續(xù)課具體章節(jié)。第68頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜柱種類(lèi)的選擇首選C18柱，可解決約80％的分離問(wèn)題。其次C8、C2等。色譜柱規(guī)格的選擇常用150mm×4.6mm、250mm×4.6mm、柱長(zhǎng)小于100mm、柱內(nèi)徑小于4.6mm的色譜柱常用于MS檢測(cè)器（流動(dòng)相流速<1.0mm）。四、選擇HPLC方法；嘗試性分離；建立分離條件第69頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天流動(dòng)相種類(lèi)的選擇反相HPLC常用的流動(dòng)相種類(lèi)一般為甲醇、乙腈、四氫呋喃、水或一定濃度的酸性水溶液（pH1~7，甲酸、乙酸、磷酸、磷酸鹽、檸檬酸、TFA等）。流動(dòng)相配比的選擇

初步實(shí)驗(yàn)：甲醇－水或乙腈—水(80:20)或(90:10)

根據(jù)峰形及分離情況，逐步調(diào)整配比，必要時(shí)改變?nèi)軇┑姆N類(lèi)和溶劑的“元”數(shù)，并適當(dāng)改變流動(dòng)相的酸度以及加入適當(dāng)?shù)摹胺劳蟿?、“改性劑”等。洗脫方式的選擇等度洗脫？？在滿(mǎn)足分離要求的情況下，首選。梯度洗脫？？第70頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天梯度洗脫描述方式：以甲醇－水二元梯度洗脫為例：

1、文字法（文獻(xiàn)表達(dá)方法）：

0-6.5min（30：70），8.5-13min（50：50）

2、表格法：（也可用于正式論文中）第71頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、圖示法以時(shí)間作為橫坐標(biāo)，以某一元的溶劑比例作為縱坐標(biāo)作圖。甲醇min305006.58.513.0甲醇－水:0-6.5min（30:70），8.5-13min（50:50）甲醇－乙腈－水:0-6.5min（20:10:70），8.5-13min