《GB-T核酸適體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》

ICS07.080

B20/39

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—2017

核酸適體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范

Generaltechniquerulesforscreeningandpreparationofaptamer

點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

GB/TXXXXX—2017

核酸適體篩選制備技術(shù)通則

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了核酸適配體篩選條件與流程的優(yōu)化，建立高效、快速、標(biāo)準(zhǔn)化的篩選技術(shù)通則。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于針對小分子、大分子、細(xì)胞、以及復(fù)雜靶標(biāo)等不同層次靶標(biāo)體系的核酸適配體篩選。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

SN/T1193基因檢驗實驗室技術(shù)要求

3術(shù)語和定義

3.1核酸適配體(Aptamer)

能夠與多種目標(biāo)物（蛋白、藥物、金屬離子、無機(jī)或有機(jī)分子、細(xì)胞、組織）發(fā)生高親和性和特異

性結(jié)合的一類單鏈核苷酸（DNA或RNA）分子。

3.2指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,

SELEX)

利用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，通過寡核苷酸對相應(yīng)靶標(biāo)物質(zhì)的高親和性

和高特異性，在隨機(jī)序列文庫中，通過多次循環(huán)選擇富集，來獲取所需的特定結(jié)構(gòu)或功能核酸適配體的

過程。

4操作步驟

4.1文庫的構(gòu)建

4.1.1DNA文庫的構(gòu)建

核酸適配體篩選的單鏈DNA文庫是由兩端的固定引物區(qū)加上中間的隨機(jī)區(qū)構(gòu)成。固定引物區(qū)的設(shè)計

遵循一般PCR引物設(shè)計規(guī)則。中間隨機(jī)區(qū)的長度決定文庫的庫容量，通常為20-50堿基。初始文庫一般包

含1015～1018個隨機(jī)DNA序列。

4.1.2RNA文庫的構(gòu)建

篩選RNA核酸適配體應(yīng)先合成DNA文庫分子且序列5’端帶有T7啟動子識別序列，轉(zhuǎn)錄成RNA分子篩選

文庫。

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GB/TXXXXX—2017

4.2不同靶標(biāo)的篩選

4.2.1細(xì)胞的篩選

細(xì)胞的篩選分為懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞篩選。懸浮細(xì)胞篩選應(yīng)通過離心法；貼壁細(xì)胞篩選應(yīng)在培養(yǎng)皿

或培養(yǎng)瓶中通過孵育清洗，吸棄上清保留細(xì)胞。

4.2.2大分子的篩選

大分子的篩選應(yīng)將大分子偶聯(lián)到固相的載體上，分析固相載體的性質(zhì)，選擇磁性分離、離心分離和

超濾分離等。

4.2.3小分子的篩選

小分子的篩選應(yīng)根據(jù)小分子靶標(biāo)的自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和核酸適配體的應(yīng)用目的，選擇固定靶標(biāo)或固定核

酸庫的方法進(jìn)行分離。

4.2.4復(fù)雜靶標(biāo)的篩選

復(fù)雜靶標(biāo)的篩選應(yīng)根據(jù)復(fù)雜靶標(biāo)的自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇電泳分離、孵育清洗分離，要考慮消減或反

篩驗證方法，保證降低非特異性結(jié)合。

4.2.5結(jié)合效率的測定

在每一輪篩選的過程中應(yīng)設(shè)立對應(yīng)的結(jié)合效率檢測實驗，根據(jù)熒光定量PCR的Cq值計算出每一輪與

靶標(biāo)結(jié)合的核酸分子數(shù)，與投入的總分子數(shù)比值，得到結(jié)合效率結(jié)果。

4.3擴(kuò)增

4.3.1常規(guī)PCR擴(kuò)增

將4.2得到的與靶標(biāo)特異性結(jié)合的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，常見的PCR體系見表1。PCR擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)

變性5～10分鐘，95℃變性，55～60℃退火，72℃延伸，擴(kuò)增35～40個循環(huán)。

表1常見的PCR體系

名稱終濃度

10×聚合酶buffer1×

dNTP0.2～0.5mM

正向引物0.025～0.5μM

反向引物0.025～0.5μM

DNA聚合酶0.02U/uL

熒光染料1～3×

模板小于總體積1/10

總體系（用水補(bǔ)足）20～100uL

4.3.2微滴式PCR擴(kuò)增

微滴式PCR應(yīng)按照4.3.1的PCR體系配置，進(jìn)行微滴生成后應(yīng)按照4.3.1的擴(kuò)增程序進(jìn)行，擴(kuò)增得到的

DNA產(chǎn)物應(yīng)通過正丁醇純化后制備單鏈。

2

GB/TXXXXX—2017

4.4次級文庫制備

DNA次級文庫的制備應(yīng)采用磁珠法、酶解法、不對稱PCR法和長短鏈法中的一種或多種。RNA文庫的

制備應(yīng)將PCR得到的雙鏈DNA為模板進(jìn)行體外的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳回收。獲得

的單鏈產(chǎn)物后應(yīng)采用分光光度計法測量A260/280，進(jìn)行質(zhì)量及純度檢驗。

4.5多輪篩選和篩選進(jìn)程監(jiān)測

將4.4獲得的靶標(biāo)與文庫孵育，分離未結(jié)合的核酸，重復(fù)4.3-4.4過程10-20次。篩選過程中應(yīng)逐輪

增加篩選壓力，方法主要包括：減少投入的單鏈DNA文庫的量、靶標(biāo)的用量和兩者的孵育時間等。

4.5.1親和力檢測

在每輪篩選的同時應(yīng)設(shè)立平行的結(jié)合效率檢測實驗。

4.5.2PCR擴(kuò)增曲線的變化監(jiān)測庫容

PCR擴(kuò)增曲線達(dá)到平臺期之后，應(yīng)停止篩選并將該輪文庫的親和力。

4.6核酸適配體分析

4.6.1克隆測序

獲得具有親和力的篩選文庫應(yīng)用未標(biāo)記的引物擴(kuò)增后進(jìn)行克隆和測序。

4.6.2高通量測序

獲得具有親和力的篩選文庫應(yīng)按照高通量測序要求準(zhǔn)備后進(jìn)行高通量測序并分析。

4.6.3核酸適配體序列結(jié)構(gòu)分析

測序結(jié)果應(yīng)利用分析生物學(xué)軟件進(jìn)行核酸適配體的同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析，并預(yù)測核酸適配體

的二級結(jié)構(gòu)。

5防污染措施

檢測過程中防止交叉污染的措施按照G