【生物】微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修三

第1章

發(fā)酵工程第2節(jié)

微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用第一章發(fā)酵工程第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用第1課時(shí)

微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)從社會(huì)中來向經(jīng)過殺菌處理的牛奶中添加某些對(duì)人體有益的細(xì)菌，再經(jīng)過發(fā)酵就可以制成酸奶，由于制作工藝并不復(fù)雜，一些人會(huì)在家里自制酸奶，自制酸奶雖然方便，但是食用自制酸奶導(dǎo)致腸胃不適的事件屢見不鮮，主要原因是在制作過程中有雜菌混入。那么，怎樣才能保證無處不在的雜菌不混入發(fā)酵物中呢？應(yīng)該先對(duì)制作用具和原料進(jìn)行滅菌處理，再接種純的菌種，并控制發(fā)酵條件，避免雜菌進(jìn)入。這需要應(yīng)用無菌技術(shù)和微生物的培養(yǎng)技術(shù)。失敗一、微生物1.微生物的概念：微生物是難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱，包括細(xì)菌、真菌、病毒及一些原生生物等。（1）無細(xì)胞結(jié)構(gòu)（病毒）：SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；噬菌體等DNA病毒。新冠病毒噬菌體人類免疫缺陷病毒1.微生物的概念：微生物是難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱，包括細(xì)菌、真菌、病毒及一些原生生物等。（2）原核細(xì)胞：藍(lán)細(xì)菌、大腸桿菌、乳酸菌、醋酸菌等細(xì)菌；鏈霉菌等放線菌。藍(lán)細(xì)菌乳酸菌醋酸菌鏈霉菌1.微生物的概念：微生物是難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱，包括細(xì)菌、真菌、病毒及一些原生生物等。衣藻本章中提及的微生物主要指用于發(fā)酵的細(xì)菌和真菌。②原生生物：草履蟲、變形蟲、衣藻等。①真菌：酵母菌、霉菌、毛霉等；酵母菌毛霉草履蟲（3）真核細(xì)胞變形蟲（1）防止雜菌污染；（2）獲得純凈的微生物培養(yǎng)物。2.研究和應(yīng)用微生物的前提（發(fā)酵工程的重要基礎(chǔ)）3.實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物的要求（1）為人們需要的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件—培養(yǎng)基（2）確保其它微生物無法混入，并將需要的微生物分離出來—無菌技術(shù)高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基二、培養(yǎng)基的配制1.培養(yǎng)基的概念：人們按照微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。2.培養(yǎng)基的分類按(物理性質(zhì)分類)（1）液體培養(yǎng)基：不含凝固劑（如瓊脂）、呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。（2）固體培養(yǎng)基：呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。①液體培養(yǎng)基中加入瓊脂后制成的瓊脂固體培養(yǎng)基是實(shí)驗(yàn)室最常用的培養(yǎng)基之一。注意：凝固劑（如瓊脂），不能被微生物利用，只起到凝固作用。2.培養(yǎng)基的分類液體培養(yǎng)基加入瓊脂瓊脂固體培養(yǎng)基②微生物在瓊脂固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長，可以形成肉眼可見的菌落。1.定義：單個(gè)或少數(shù)同種菌體在固體培養(yǎng)基上大量繁殖，形成肉眼可見的子細(xì)胞群體。2.特征：形狀、大小、顏色、光澤度、透明度等。3.功能：菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。知識(shí)補(bǔ)充：菌落沙門氏菌毛霉青霉菌酵母菌3.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成（1）各種培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)。1000mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成注：牛肉膏和蛋白胨來源于動(dòng)物，含有糖、維生素和有機(jī)氮等營養(yǎng)物質(zhì)。思考（P10）：為什么培養(yǎng)基需要氮源？氮是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)必須的元素。微生物的化學(xué)組成大體相同，主要由C、H、O、N、P、S等大量元素和Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo等微量元素組成，這些元素最終來自外界環(huán)境中的各種有機(jī)物和無機(jī)物。思考：為什么各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都有水、無機(jī)鹽、碳源和氮源？3.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成提供碳元素的物質(zhì)提供氮元素的物質(zhì)3.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成為微生物提供除碳、氮以外的各種重要元素，包括大量元素和微量元素由于缺乏合成這些物質(zhì)所需的酶或合成能力有限（2）培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對(duì)pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的需求。④培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)，需要提供

的條件。①培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)，需要在培養(yǎng)基中添加

；②培養(yǎng)霉菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至

；③培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至

；維生素酸性中性或弱堿性無氧3.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成三、無菌技術(shù)消毒滅菌1.獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染。無菌技術(shù)應(yīng)圍繞著如何避免雜菌污染展開。二、無菌技術(shù)二、無菌技術(shù)2.無菌技術(shù)的類型（1）消毒①概念：使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。②適用對(duì)象：對(duì)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒。（2）滅菌①概念：使用強(qiáng)烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有微生物，包括芽孢和孢子。②適用對(duì)象：用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。芽孢指某些細(xì)菌（如芽孢桿菌等）在一定條件下細(xì)胞質(zhì)高度濃縮脫水所形成的一種抗逆性很強(qiáng)的球形或橢圓形的休眠體。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。如某些細(xì)菌的芽孢煮沸3小時(shí)才死亡。每個(gè)細(xì)菌僅形成一個(gè)芽孢。孢子指細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的生殖細(xì)胞。正常情況下不需要兩兩結(jié)合就可以由單個(gè)細(xì)胞直接發(fā)育成新個(gè)體。知識(shí)拓展3.常用的消毒和滅菌方法（1）常用的消毒方法*：照射前適當(dāng)噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強(qiáng)消毒效果。3.常用的消毒和滅菌方法（1）常用的消毒方法煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥物消毒法紫外線消毒法消毒方法超凈工作臺(tái)相關(guān)信息（p10）：生物消毒法是指利用生物或其代謝物除去環(huán)境中的部分微生物的方法。例如有的微生物能夠寄生于多種細(xì)菌體內(nèi)，使細(xì)菌裂解，因此可以用它們來凈化污水、污泥。濕熱滅菌：利用沸水、流通蒸汽或高壓蒸汽進(jìn)行滅菌的方式。高壓蒸汽滅菌鍋易錯(cuò)提醒高壓蒸汽滅菌的2個(gè)注意點(diǎn)（1）高壓蒸汽滅菌開始之前要將鍋內(nèi)的冷空氣排盡。因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒魵獾呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸氣中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。（2）滅菌完畢后，要待壓力降到0時(shí)才能打開排氣閥。否則會(huì)導(dǎo)致鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。干熱滅菌箱干熱滅菌：干熱滅菌箱內(nèi)160-170℃下加熱2-3h。充分燃燒層（外焰）灼燒滅菌：直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒。接種針接種環(huán)涂布器4.防止雜菌污染的措施（1）實(shí)驗(yàn)前：①對(duì)操作空間、操作人員消毒；②對(duì)所用器皿、接種用具和培養(yǎng)基滅菌。①避免已滅菌處理材料用具與周圍物品接觸造成污染；②為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作都應(yīng)在超凈工作臺(tái)并在酒精燈火焰旁進(jìn)行。（2）操作時(shí)：P10旁欄思考：無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？還能有效避免操作者自身被微生物感染。4.防止雜菌污染的措施（3）實(shí)驗(yàn)后：使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。

濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌）干熱滅菌灼燒滅菌化學(xué)藥物消毒（酒精）紫外線消毒巴氏消毒法【鞏固練習(xí)】以下所采用的滅菌或消毒方法依次是化學(xué)藥物消毒（次氯酸鈉）培養(yǎng)基培養(yǎng)皿接種環(huán)實(shí)驗(yàn)操作者的雙手實(shí)驗(yàn)室牛奶有活性生物材料四、微生物的純培養(yǎng)123451.培養(yǎng)物：在微生物學(xué)中，將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體成為培養(yǎng)物。（一）相關(guān)概念3.純培養(yǎng)：獲得純培養(yǎng)物的過程就是純培養(yǎng)，包括制備培養(yǎng)基（包括配制培養(yǎng)基、滅菌、倒平板）、接種、分離和培養(yǎng)等步驟。2.純培養(yǎng)物：由單一個(gè)體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物。（二）酵母菌的純培養(yǎng)不同菌落的大小、形狀、光澤度、顏色等不同。1.純培養(yǎng)的原理（1）分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，這就是菌落（菌落屬于種群）。（2）采用平板劃線法和稀釋涂布平板法能將單個(gè)微生物分散到固體培養(yǎng)基上，之后經(jīng)培養(yǎng)得到的單菌落一般是由單個(gè)微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。微生物群分散單個(gè)細(xì)胞單個(gè)菌落繁殖2.目的要求（1）學(xué)會(huì)配制培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基并倒平板。（2）學(xué)會(huì)進(jìn)行無菌操作。（3）嘗試通過平板劃線操作來獲得純化的酵母菌菌落。（二）酵母菌的純培養(yǎng)酵母菌菌落：濕潤，粘稠，易挑起，表面光華，比細(xì)菌的菌落大而厚。①配制培養(yǎng)基：稱取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向?yàn)V液中加入20g葡萄糖、15-20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml（定容）。（1）制備培養(yǎng)基（二）酵母菌的純培養(yǎng)3.方法步驟②滅菌：將配制好的培養(yǎng)基（濕熱滅菌）轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力為100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15-30min。將5-8套培養(yǎng)皿（干熱滅菌）包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160-170℃滅菌2h。（1）制備培養(yǎng)基（二）酵母菌的純培養(yǎng)3.方法步驟Ⅰ.拔出錐形瓶的棉塞。Ⅱ.將瓶口迅速通過該火焰。Ⅲ.用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養(yǎng)基（10-20ml）倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋。Ⅳ.等待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒過來放置。（1）制備培養(yǎng)基③倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板。2.倒平板要在酒精燈火焰附近進(jìn)行？思考·討論防止空氣中微生物污染。3.將瓶口迅速通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。1.如何估計(jì)培養(yǎng)基的溫度（50℃左右）？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。6.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？5.平板冷凝后，要將平板倒置？思考·討論防止皿蓋上的冷凝水落入培養(yǎng)基造成污染。將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。4.倒平板時(shí)不能將培養(yǎng)皿完全打開？防止空氣中雜菌污染。（1）培養(yǎng)基滅菌后，需冷卻至50℃左右時(shí)才能倒平板，溫度過高會(huì)燙手，溫度過低培養(yǎng)基又會(huì)凝固。（2）整個(gè)操作在酒精燈火焰旁附近進(jìn)行，避免周圍環(huán)境中微生物的污染。（3）平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。倒平板的注意事項(xiàng)（4）倒平板時(shí)不要將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間，否則此培養(yǎng)基不能用來培養(yǎng)微生物，因?yàn)榭諝庵械奈⑸锟赡茉诿笊w與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。（5）將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。倒平板的注意事項(xiàng)2.接種和分離酵母菌（1）平板劃線法：通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。經(jīng)過數(shù)次劃線后培養(yǎng)可以分離得到單菌落。單個(gè)細(xì)胞微生物群單個(gè)菌落連續(xù)劃線分散或稀釋生長繁殖單菌落（2）平板劃線法的具體操作2.接種和分離酵母菌①將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)的金屬絲燒紅。②在火焰旁冷卻接種環(huán)。同時(shí)，拔出裝有酵母菌培養(yǎng)液的試管的棉塞。③將試管口通過火焰（灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基）。④在火焰附近用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液。⑤將試管口通過火焰，并塞上棉塞。⑥在火焰附近將皿蓋打開一條縫隙，用接種環(huán)在培養(yǎng)基表面迅速劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復(fù)以上操作，作第三、四、五次劃線。注意不要將最后一次的劃線與第一次的劃線相連。（2）平板劃線法的具體操作2.接種和分離酵母菌1.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？2.為什么每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。思考·討論第一次劃線前：殺死接種環(huán)上的微生物，避免污染培養(yǎng)物。第二次及以后劃線前：殺死上次劃線時(shí)殘留菌種，保證每次劃線菌種來自上次劃線末端。3.劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？殺死殘留菌種，避免污染環(huán)境和感染操作者。思考·討論4.劃五次線，接種環(huán)需要灼燒幾次？第1次劃線接種環(huán)滅菌第2次劃線接種環(huán)滅菌第3次劃線接種前接種環(huán)滅菌接種環(huán)滅菌第4次劃線接種環(huán)滅菌第5次劃線接種環(huán)滅菌需要灼燒6次。5.第二次及以后的劃線時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？6.為什么不能將最后一次的劃線與第一次的劃線相連？將聚集的菌種逐步稀釋，以便獲得單菌落。線條末端酵母菌的數(shù)目比起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使酵母