大鼠心肌缺血再灌注兩種不同TTC染色方法的比較

作者簡(jiǎn)介：李糧輝(1990-)，女，碩士，研究方向：心肌保護(hù)，E-mail:huixiaoyi68@163.com通訊作者：陳文華，男，教授、研究生導(dǎo)師，E-mail作者簡(jiǎn)介：李糧輝(1990-)，女，碩士，研究方向：心肌保護(hù)，E-mail:huixiaoyi68@163.com通訊作者：陳文華，男，教授、研究生導(dǎo)師，E-mail:whc6202@163.com李糧輝1，陳文華1，鄭宏2（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科，福州，350001；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院麻醉科，福州，350025）【摘要】目的：比較應(yīng)用不同2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色方法對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后梗死面積的檢測(cè)效果。方法：將20只SD大鼠(雄性、8周齡，體重250～300g)按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，每組10只，A組：傳統(tǒng)TTC染色法組，B組：改進(jìn)后的TTC染色法組，分別進(jìn)行大鼠心肌染色,隨后計(jì)算心肌梗死面積及測(cè)定血清cTnI濃度水平。結(jié)果：A組和B組均能較好地標(biāo)記梗死心肌;A組和B組心肌梗死面積百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（48.69±5.37%VS47.41±3.28%，P>0.05）；A組和B組血清cTnI濃度水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（4.51±0.88ng/mlVS4.70±0.71ng/ml，P>0.05）；但B組心肌切片染色色澤對(duì)比度及心肌非梗死區(qū)與梗死區(qū)區(qū)分度均高于A組。結(jié)論：改進(jìn)后的心肌TTC染色法采用在體染色，不僅操作簡(jiǎn)便，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，而且提高了染色效果，能更準(zhǔn)確地反映心肌缺血再灌注損傷的程度。因此改進(jìn)后的心肌TTC染色法是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快捷、高效的染色方法。【關(guān)鍵詞】缺血再灌注;心肌梗死面積;2，3，5-氯化三苯基四氮唑;染色AComparisonofTwoDifferentTTCStainingMethodsforIschemia-reperfusionMyocardiuminRatsLILiang-hui1，CHENWen-hua1，ZHENGHong2(1.DepartmentofAnesthesiology,Fujianmedicineuniversityaffiliatedxiehehospital,Fuzhou350001,China;DepartmentofAnesthesiology,FuzhougeneralhospitalofNanjingmilitarycommand,Fuzhou350025,China)【Abstract】ObjectiveTocomparethedifferentTTCstainingmethodsofmeasuringmyocardialinfarctsizeafterischemia-reperfusioninrats.Methods20RatswererandomlydividedintotwogroupsincludinggroupAwithtraditionalTTCdyeingmethodandgroupBwiththemodifiedTTCdyeingmethodforischemia-reperfusionmyocardium,theninfractsizewascaculatedandthelevelsoftheirserumcTnIweredetermined.ResultsBothgroupAandgroupBdetectedtheinfarctedmyocardiumwell;therewerenosignificantdifferenceinthemyocardialinfarctsizebetweengroupAandgroupB（48.69±5.37%VS47.41±3.28%，P>0.05）;therewerenosignificantdifferenceinthelevelsofserumcTnIbetweengroupAandgroupB（4.51±0.88ng/mlVS4.70±0.71ng/ml，P>0.05）;butcomparewithA,thecolourcontrastofdyedmyocardialsliceandthedifferentiationofinfarctionareaandnon-infarctionareaweremuchcleareringroupB.ConclusionsThemodifiedTTCdyeingmethodusingInvivostainingisakindofeconomic,convenient,fastandefficientmethodwithbeingeasytocontrol,savingexperimentaltimeandexpense,improvingthedyeingeffects,evaluatingthesizeofmyocardialischemia/reperfusioninjurymoreaccurately.【Keywords】ischemia/reperfusion；myocardialinfarctsize；2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride；staining心肌缺血再灌注損傷是近十幾年來(lái)醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)之一,其重要的病理特征之一是出現(xiàn)心肌梗死區(qū)。而心肌梗死面積是評(píng)價(jià)心肌缺血再灌注損傷的一個(gè)重要指標(biāo)[1]MusiolikJ，vanCasterP，SkyschallyA，etal．Reductionofinfarctsizebygentlereperfusionwithoutactivationofreperfusioninjurysalvagekinasesinpigs[J].CardiovascRes，2010，85（1）：110－117.[2]OstadalB．Thepast,thepresentandthefutureofexperimentalresearchonmyocardialischemiaandprotection[J].PharmacolRep，2009，61（1）：3－12.[3]GononAT，WidegrenU，BulhakA，etal．Adiponectinprotectsagainstmyocardialischaemia-reperfusioninjuryviaAMP-activatedproteinkinase,Akt,andnitricoxide[J].CardiovascRes,2008，78（1）：116－122.。2，3，5-氯化三苯基四氮（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC）染色法常用于估計(jì)心肌梗死面積[4]HolmbomB,NaslundU,ErikssonA,etal．Comparisonoftriphenyltetrazoliumchloride(TTC)stainingversusdetectionoffibronectininexperimentalmyocardialinfarction[J].Histochemistry,1993,99(4):265-275.[1]MusiolikJ，vanCasterP，SkyschallyA，etal．Reductionofinfarctsizebygentlereperfusionwithoutactivationofreperfusioninjurysalvagekinasesinpigs[J].CardiovascRes，2010，85（1）：110－117.[2]OstadalB．Thepast,thepresentandthefutureofexperimentalresearchonmyocardialischemiaandprotection[J].PharmacolRep，2009，61（1）：3－12.[3]GononAT，WidegrenU，BulhakA，etal．Adiponectinprotectsagainstmyocardialischaemia-reperfusioninjuryviaAMP-activatedproteinkinase,Akt,andnitricoxide[J].CardiovascRes,2008，78（1）：116－122.[4]HolmbomB,NaslundU,ErikssonA,etal．Comparisonoftriphenyltetrazoliumchloride(TTC)stainingversusdetectionoffibronectininexperimentalmyocardialinfarction[J].Histochemistry,1993,99(4):265-275.[5]王波，李慶志，閻德民，等.不同2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色方式對(duì)心肌梗死面積檢測(cè)的對(duì)比[J].中國(guó)胸心血管外科臨床雜志,2011,18(2):179-180.[6]劉丹妮,馬芹芹，黃秀蘭.健康大鼠及急性心肌缺血大鼠心電圖表現(xiàn)[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2010,39(3):11-14.1材料和方法1.1動(dòng)物及分組清潔級(jí)SD大鼠20只，雄性，8周齡，體重250g～300g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(SCXK滬2012-0005)，實(shí)驗(yàn)操作地址：福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為2組，每組10只，A組：傳統(tǒng)TTC染色法組，B組：改進(jìn)后的TTC染色法組。1.2實(shí)驗(yàn)材料和器材10%水合氯醛注射液（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院試劑，批號(hào)：120419）；37%～40%甲醛溶液（上海天蓮精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20090610）；磷酸鹽（PBS）緩沖液（福州中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20120918）；EVANS’Blue粉劑（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：00281342）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）粉劑（美國(guó)Amersco公司，批號(hào)：00332543）；手術(shù)器械一套（上海醫(yī)療器械廠）；小動(dòng)物呼吸機(jī)（TKR-200C型，江西特力麻醉呼吸設(shè)備公司）；圖形分析軟件ImageProPlusV6.0(美國(guó)MediaCybernatics公司）；數(shù)碼攝像機(jī)（LX5型，松下電器（中國(guó)）有限公司）1.3大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的建立用10%水合氯醛溶液3.5ml/kg腹腔注射麻醉，取仰臥體位固定四肢和牙齒。參考文獻(xiàn)[7]何濤,李海霄.健康大鼠胸導(dǎo)聯(lián)心電圖分析[J].實(shí)用心電學(xué)雜志,2010,19(2):86-88.[8]王卓瓔，張?chǎng)?，李曉珍，?兩種測(cè)定大鼠心肌缺血再灌注損傷后梗死面積方法的比較[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2011,31(8):1101-1105.的方法，將5個(gè)電極針?lè)謩e插入大鼠的四肢皮下和胸骨體下緣平面與腋前線交匯處皮下，溫控探頭監(jiān)測(cè)大鼠肛溫，術(shù)中重點(diǎn)觀察V5、I、II、III導(dǎo)聯(lián)心電圖。并行股靜脈和頸動(dòng)脈置管。參考文獻(xiàn)[9]Li-yingZ,Zhong-yuanX,FangX,etal.Effectofradixpaeoniaerubraonexpressionofp38MAPK/iNOS/HO-1inratswithlipopolysaccharide-inducedacutelunginjury[J].ChinJTraumatol,2007,10(5):269-274.9][10]YangJ，MardenJJ,ChenguangFan,etal.Geneticredoxpreconditioningdifferent-iallymodulatesAP-1andNFkappaBresponsesfollowingcardiacischemia/reperfusioninjuryandprotectsagainstnecrosisandapoptosis[J].MolTher,2003，7(3):341-353.的方法并改進(jìn)，用20G靜脈留置針充當(dāng)氣管導(dǎo)管在大鼠氣管環(huán)甲膜處行環(huán)甲膜穿刺置套管外接小動(dòng)物呼吸機(jī)，行機(jī)械通氣（通氣頻率為60次/分，吸呼比為1：1.5）。取左側(cè)第四肋間開(kāi)胸，剝離心包，在左心耳下方約2mm處用眼科小圓針5/0線穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）下方,可逆性結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD），肢體導(dǎo)聯(lián)或胸導(dǎo)聯(lián)心電圖出現(xiàn)ST段抬高0.2mV以上或者出現(xiàn)增高增寬的QRS波，說(shuō)明結(jié)扎LAD成功。心肌缺血45min[7]何濤,李海霄.健康大鼠胸導(dǎo)聯(lián)心電圖分析[J].實(shí)用心電學(xué)雜志,2010,19(2):86-88.[8]王卓瓔，張?chǎng)?，李曉珍，?兩種測(cè)定大鼠心肌缺血再灌注損傷后梗死面積方法的比較[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2011,31(8):1101-1105.[9]Li-yingZ,Zhong-yuanX,FangX,etal.Effectofradixpaeoniaerubraonexpressionofp38MAPK/iNOS/HO-1inratswithlipopolysaccharide-inducedacutelunginjury[J].ChinJTraumatol,2007,10(5):269-274.[10]YangJ，MardenJJ,ChenguangFan,etal.Geneticredoxpreconditioningdifferent-iallymodulatesAP-1andNFkappaBresponsesfollowingcardiacischemia/reperfusioninjuryandprotectsagainstnecrosisandapoptosis[J].MolTher,2003，7(3):341-353.1.4血清CtnI測(cè)定24hr后為再灌注結(jié)束時(shí)間，大鼠10%水合氯醛溶液3.5ml/kg腹腔注射麻醉，剪開(kāi)腹腔，用2ml注射器從下腔靜脈抽取約2ml血液，裝入離心管，低溫高速離心機(jī)離心15min，轉(zhuǎn)速3000r/min。將離心分離后的血清分裝入新的離心管內(nèi)，密封，標(biāo)記，采用全自動(dòng)生化儀（BeckmanDxC800）檢測(cè)血清CtnI濃度。1.5染色方法A組參考文獻(xiàn)[11]王燕,胡慧媛,趙美瞇,等.TTC染色評(píng)價(jià)豚鼠離體心臟缺血/再灌注損傷梗死面積的適宜觀察時(shí)間及計(jì)算方法[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,42(2):160-164.1]按照傳統(tǒng)染色方法染色：大鼠心肌缺血再灌注結(jié)束時(shí)開(kāi)胸，由下腔靜脈取血2ml后重新原位結(jié)扎大鼠LAD，從大鼠下腔靜脈注射1%伊文思藍(lán)溶液2ml，取出心臟，經(jīng)-70[11]王燕,胡慧媛,趙美瞇,等.TTC染色評(píng)價(jià)豚鼠離體心臟缺血/再灌注損傷梗死面積的適宜觀察時(shí)間及計(jì)算方法[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,42(2):160-164.B組采用改進(jìn)后的染色方法：大鼠心肌缺血再灌注結(jié)束時(shí)開(kāi)胸，由下腔靜脈取血2ml后從大鼠下腔靜脈處緩慢注射1%TTC溶液共計(jì)1ml，然后原位結(jié)扎大鼠LAD，再?gòu)拇笫笙虑混o脈注射1%伊文思藍(lán)溶液2ml，當(dāng)大鼠口唇變藍(lán)時(shí)，取出心臟，用生理鹽水沖洗多余染料，用吸水濾紙吸干多余水分，經(jīng)-70℃冰箱速凍15min后取出。快速以垂直心臟長(zhǎng)軸的角度，從心尖到結(jié)扎結(jié)處平行切取心肌，心尖端的一點(diǎn)心肌棄之不用，剩下部分均勻切成5片，每片厚度約1mm。1.6心肌梗死面積測(cè)定染色完成后，數(shù)碼相機(jī)拍攝心肌切片圖像,經(jīng)過(guò)Image-proPlusV6.0圖像處理軟件分析計(jì)算出梗死區(qū)面積（Infactsize,IS）和缺血區(qū)（Areaatrisk,AAR）的比值，即可計(jì)算出心肌梗死面積百分比（IS/AAR%）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來(lái)表示，計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1心肌梗死面積百分比（IS/AAR%）A組心肌切片染色色澤對(duì)比度較低，心肌非梗死缺血區(qū)染色多呈灰紅色，梗死區(qū)多呈現(xiàn)灰黃色，心肌非梗死缺血區(qū)和梗死區(qū)區(qū)分度較差，不便于計(jì)算機(jī)圖形軟件識(shí)別處理計(jì)算（圖1）。B組心肌切片染色色澤對(duì)比度較高，心肌非梗死缺血區(qū)染色多呈明顯的磚紅色，梗死區(qū)多呈現(xiàn)黃白色，心肌非梗死缺血區(qū)和梗死區(qū)區(qū)分度較好，便于計(jì)算機(jī)圖形軟件識(shí)別處理計(jì)算（圖2）。A組心肌梗死面積（48.69±5.37）%，B組心肌梗死面積（47.41±3.28）%；二組心肌梗死面積無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見(jiàn)圖3所示。2.2血清cTnI濃度A組血清cTnI濃度為4.51±0.88ng/ml，B組血清cTnI濃度為4.70±0.71ng/ml；二組血清cTnI濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖4。圖3心肌梗死面積百分比Fig.3thepercentageofmyocardialinfarctsize圖4大鼠血清cTnI濃度Fig.4thelevelsofrats’serumcTnI3討論氯化三苯基四氮唑(TTC)染色是一種用來(lái)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟梗死面積最常見(jiàn)的染色方法[12]KakimotoY,TsuruyamaT，MiyaoM,etal．Theeffectivenessandlimitationsoftriphenyl-tetrazoliumchloridetodetectacutemyocardialinfarctionatforensicautopsy[J].AmJForensicMedPathol,2013，34（3）:242-247.2]。因其染色后顏色較易觀察且靈敏性高而被廣泛用于狗、大鼠、貓、豬的心肌或腦組織缺血模型梗死面積的評(píng)估[13]DosSantosL，MelloAF，AntonioEL，eta1．Determinationofmyocardialinfarctionsizeinratsbyechocardiographyandtetrazoliumstaining：correlation，agreements，andSimplifications[J]．BrazJMedBidRes,2008，41(3)：199—201．[14]XingYQ,ZhangY，LiDQ,etal．Comparisonoftheveracityofreal-timeperfusion,harmonicangio,andultraharmonicmocardialcontrastimagingmodesinevaluationofacutemyocardialinfarctionarea[J].ChinMedJ(Engl),2006，119（3）:179-184.[15]MdzinarishviliA,GeldenhuysWJ，AbbruscatoTJ,etal.NGP1-01,alipophilic[12]KakimotoY,TsuruyamaT，MiyaoM,etal．Theeffectivenessandlimitationsoftriphenyl-tetrazoliumchloridetodetectacutemyocardialinfarctionatforensicautopsy[J].AmJForensicMedPathol,2013，34（3）:242-247.[13]DosSantosL，MelloAF，AntonioEL，eta1．Determinationofmyocardialinfarctionsizeinratsbyechocardiographyandtetrazoliumstaining：correlation，agreements，andSimplifications[J]．BrazJMedBidRes,2008，41(3)：199—201．[14]XingYQ,ZhangY，LiDQ,etal．Comparisonoftheveracityofreal-timeperfusion,harmonicangio,andultraharmonicmocardialcontrastimagingmodesinevaluationofacutemyocardialinfarctionarea[J].ChinMedJ(Engl),2006，119（3）:179-184.[15]MdzinarishviliA,GeldenhuysWJ，AbbruscatoTJ,etal.NGP1-01,alipophilicpolycycliccageamine,isneuroprotectiveinfocalischemia[J].NeurosciLett,2005，383:49-53.[16]VeeravalliKK,AkulaA，KotaMK,etal．Nitricoxide-andprostaglandin-mediatedcardioprotectionbybradykinininmyocardialischemiaandreperfusioninjury[J].PolJPharmacol,2003，55（6）:1021-1029.[17]KhalilPN，SiebeckM，HussR,etal．Histochemicalassessmentofearlymyocardialinfarctionusing2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorideinblood-perfusedporcinehearts[J].JPharmacolToxicolMethods,2006，54（3）:307-312.[18]OkunoS，NakaseH，SakakiT,etal．Comparativestudyof2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride(TTC)andhematoxylin-eosinstainingforquantificationofearlybrainischemicinjuryincats[J].NeurolRes,2001,23(6):657-661.[19]師恩祎,江曉菁,白菡,等.嗎啡預(yù)處理的晚期心肌保護(hù)作用及其與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的關(guān)系[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(11):891-895.[20]FerreraR，BenhabboocheS，BopassaJC，eta1．Onehourreperfusionisenoughtoassessfunctionandinfarctsizewith1rrCstaininginlangendorffratmodel[J]．CardiovascDrugsTher,2009，23(4)：327—331．以往文獻(xiàn)[21]BacaksizA，TekerME，BuyukpinarbasiliN,etal．Doespantoprazoleprotectagainstreperfusioninjuryfollowingmyocardialischemiainrats?[J].EurRevMedPharmacolSci,2013,17:269-275.5][22][21]BacaksizA，TekerME，BuyukpinarbasiliN,etal．Doespantoprazoleprotectagainstreperfusioninjuryfollowingmyocardialischemiainrats?[J].EurRevMedPharmacolSci,2013,17:269-275.[22]HaT，HuY，LiuL，etal．TLR2ligandsinducecardioprotectionagainstischaemia/reperfusioninjurythroughaPI3K/Akt-dependentmechanism[J]．CardiovascRes,2010，87（4）：694－703.圖1A組n=10，心肌非梗死缺血區(qū)圖2B組n=10，心肌非梗死缺血區(qū)染色多呈灰紅色，梗死區(qū)多呈現(xiàn)灰黃染色多呈明顯的磚紅色，梗死區(qū)多呈色現(xiàn)黃白色Fig.1GroupAn=10，ThecolourofFig.2GroupBn=10，Thecolourofnon-infarctionareaisred-gray，non-infarctionareaisbrick-red，Thecolourofinfarction