16SrDNA鑒定細菌的方法

16SrDNA鑒定細菌的方法細菌16SrDNA鑒定主要分為7個部分:提取細菌基因組DNA,設計/選擇引物進行PCR擴增，電泳檢測純度與大小。瓊脂糖凝膠電泳分離膠回收目的片段目的片段測序。BLAST比對獲取相似片段。構建系統(tǒng)進化樹試劑:培養(yǎng)基：通常選擇組分簡單且細菌生長良好的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組分過于復雜會影響DNA勺提取效果，也可以在裂解細菌前用TE緩沖液對菌體進行洗滌。)。1MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)(1L)：121.1gTris，加濃鹽酸約(70ml,60mL42ml),高溫高鹽滅菌后，室溫保存。冷卻到室溫后調pH,每升高1C,pH大約下降0.03個單位。(Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L,25C)50ml0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與xml0.1mol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml。Tris緩沖液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質的溶劑，Tris也是蛋白質電泳緩沖液的主要成分之一)0.5MEDTA(pH8.0)(1L)：186.1gNa2EDTA?2H2O用NaOH調pH至8.01.約20g)，高溫高壓滅菌，室溫保存。(配置方法1.稱取186.1gNa2EDT?2H2O置于1L燒杯中。2.加入約800mL的去離子水，充分攪拌。3.用NaOH調節(jié)pH值值8.0(約20gNaOH。注意：pH值至8.0時，EDTA才能溶解。4.加去離子水將溶液定容至1L。5.適量分成小份后，高溫高壓滅菌。6.室溫保存。)1.4 10XTEBuffer(緩沖液)(pH7.4,7.6,8.0)(1L)：組分：100mMTris-HCl,10mMEDTA1MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)取100ml,0.5MEDTA(pH8.0)取20ml。高溫高壓滅菌，室溫保存。1XTEBuffer用10XTEBuffer稀釋10倍即可。1.510%SDS(W/V:稱10gSDS68E加熱溶解，用濃鹽酸調pH至7.2。室溫保存。用之前在65E溶解。配置時要戴口罩。&5MNaCI:稱292.2gNaCl,高溫高壓滅菌，4c保存。7、CTAB/NaCI(10%CTAJB0.7MNaCl)：溶解4.1gNaCl,加10gCTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，加熱攪拌。用之前在65E溶解。8、氯仿/異戊醇：按氯仿：異戊醇=24：1(V/V)的比例加入異戊醇。9、酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)：按苯酚與氯仿/異戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚與氯仿/異戊醇。10、TAE緩沖液：使用液1X：0.04mol/LTris-乙酸，0.001mol/LEDTA。濃儲存液50X：242gTris，57.1ml冰醋酸，100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)。11、6X上樣緩沖液(100ml)：0.25%溴酚藍(BPB,40淞糖，10mmol/LEDTA(pH8.0)(0.2ml),4c保存。12、0.6%瓊脂糖凝膠：稱取0.3g瓊脂糖用TAE溶液配置50ml。13、EB10mg/ml。稱取1g溴化乙錠定容至100ml。棕色瓶室溫避光保存。EB的工作濃度為0.5ug/ml。當配置50ml瓊脂糖凝膠時加入EB為2.5ul。(因EB是劇毒物質，目前很多實驗室用生物熒光染料替代，常用的有Gelred等)14、蛋白酶K:20mg/ml溶于水，-20°C保存，反應濃度50ug/ml，反應緩沖液：0.01mol/LTris(pH7.8),0.005mol/LEDTA,5%SDS反應溫度37-56C。無需預處理。15、RNaseA:10mg/ml。25mgRNaseA力口1MTris(pH7.5)25ul，2.5MNaCI15ul，無菌水2460ul，于100C加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20C。(為避免RNA的干擾，使用RNA酶降解基因組中的RNA)1.1細菌基因組DNA提取基本步驟：材料準備破碎細胞或胞膜一內容物釋放.J核算分離、純化沉淀或吸附核酸，并去除雜質核酸溶解在適量緩沖液或水中基因組DNA提取所需儀器：高速冷凍離心機、恒溫冰箱、移液器、水平電泳槽、紫外/熒光觀測儀細菌基因組DNA提取方法綜述細菌基因組DNA的提取方法主要有5種。不同的方法所選擇的試劑會有所不同1快速微量提取法取1.5ml菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心1min,丟去上清夜，收集菌體。加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH7-8混勻，置于37°C水浴1hr。然后加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000rpm離心15min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M,pH8.0),-20度保存1小時后，13000rpm離心15min,棄上清液，沉淀用70%L醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4c保存?zhèn)溆谩?蛋白酶/SDS法制備用10ml含適當抗生素的GBMS夜培養(yǎng)Delftiasp.4000rpm離心10min收集菌體，用WashingTE(50mmol/LTris-HCIpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0)洗菌體2次。將菌體充分懸浮在5ml1xTE緩沖液中，先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10%SDS，輕輕混勻后50T放置3h-5h。用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯仿抽提一次。(取上清液。乙醇沉淀DNA用自動移液器吸管頭將絮狀DNA沉淀塊吸附到Ep管中，70%L醇洗2次，干燥后溶于適當1XTE或ddHO中。3細菌培養(yǎng)：細菌接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37°C搖床(300rpm)培養(yǎng)過液。細菌收集：取1ml培養(yǎng)物于1.5mlEP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1mlTE(pH8.0)中(用ddHO也行)。菌體裂解：加入6Pl50mg/ml的溶菌酶，37C作用2h。再加2mol/LNaCI50Pl,10%SDS10yl,20mg/ml的蛋白酶K3Pl,50C作用3h或37C過夜。(此時菌液應為透明粘稠液體)。抽提：菌液均分到兩個1.5mlEP管，加等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)，混勻，室溫放置5-10min。12000rpm離心10min。抽提兩次。(上清很粘稠，吸取時應小心，最好槍頭尖應剪去)。沉淀：加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。12000rpm離心10。洗滌：沉淀用75%勺乙醇洗滌。抽(涼)干后，溶于50PlddH20中，取2-5Pl電泳。作PCR模板用。5CTAB/NaCl裂解法接兩環(huán)菌(0.75ml甘油管菌液)于25mlLB培養(yǎng)基中，37C、200r/min培養(yǎng)24h。取1.5ml菌液于1.5mlEppendof離心管中，8000r/min離心5分鐘,棄去上清。加入1.5mlTE離心洗滌后,用567ulTE溶解菌體，混勻。加入30Pl10%SDS和3ul20mg/ml的蛋白酶K(100ug/ml)，混勻，于37C溫育1h。加入100Pl5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80PlCTAB/NaCl,混勻,65C溫育10分鐘。加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1) (0.8ml),混勻,12000r/min離心5分鐘,保留上清。上清中加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)(0.8ml),混勻,12000r/min離心5分鐘,保留上清。加入0.6倍的異丙醇(0.48ml),輕輕混合直到DNA沉淀下來(0.5h),12000r/min離心15分鐘，收集DNA沉淀，用75%乙醇(1ml)12000r/min離心5分鐘洗滌DNA沉淀，真空干燥0.5h。用50ul雙蒸水溶解DNA,加入終濃度為20Pg/mIRNaseA,4c保存。用0.6%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的DNA，每孔點樣6PI(4PI樣品+2PIloadingbuffer),80V,buffer),80V,電泳1.5小時。2.設計選擇引物進行16SrDNA的PCRT增一般細菌鑒定選擇通用引物，最常用的通用引物為 27F/1492RO27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1492R5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'實驗原理PCR多聚酶鏈式反應(polymerasechainreaction)簡稱PCR技術，是80年代中期發(fā)展起來的一種體外擴增特異DNA片段的技術。此法操作簡便， 可在短時間內在試管中獲得數百萬個特異的目的DNA序列的拷貝，PCR技術雖然問世僅數年時間，但它已迅速滲透到分子生物學的各個領域，引起了生物技術發(fā)展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基礎檢測，遺傳病的基因診斷，法醫(yī)引物和4引物和4種脫PCR技術實際上是模擬體內DNA合成過程,是在模板DNA,氧核甘酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合反應，PCR技術的特異性取決于引物和模板DNA結合的特異性。反應分三步：①變性(denaturation)(denaturation)；②退火(annealing)；③延伸(extension),反應過程見圖。16SrDNA的核酸序列分析16SrDAN是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16SrRNA的基因，是細菌分類學研究中最常用、最有用的“分子鐘”。16SrRNA的序列高度保守，可精確指示細菌之間的親緣關系，16SrRNA的大小為1500bp左右，所含信息能反映生物界進化關系，易操作，適用于各級分類單元。目前常用的是建立在 PCR技術基礎上

的16SrRNA基因的直接測序法，方便快捷。較之 23SQNA等看家基因而異，它10具有分子大小適中，突變率小等優(yōu)點，素有〃細菌化石〃之稱。其序列包含10個可變區(qū)(variableregion )和與之相同的11個恒定區(qū)(constantregion),EucaryaIS-25SIS-25S可變區(qū)因細菌而異，且變異程度與細菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關。US1￡-1235US1￡-1235Step1:DNA熱變性；Step2:引物退火；Step3:引物延伸22PCR反應標準體系DNA模板引物反應緩沖液dNTPddH20耐熱聚合酶PCR反應體系各組分的作用和使用量及反應條件DNA模板：反應中DNA量在50 ng?200ng左右。且DNA純度較高， 以增加反應特異性。dNTP反應體系中達100PM-200PMMg2+Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低Taq酶活力降低；太高反應特異性降低。引物：根據目的基因兩側特定序列設計。引物約20堿基左右；G+C含量在 40%—70%之間；弓I物內部不能有回該序列；引物3'端不能互補。Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性DNA聚合酶，在95C時30分鐘還有50%活力。變性溫度：在93?95C之間使模板充分變性。復性溫度：55C左右，此溫度選擇是根據模板和引物配對結合強弱而定， 它是反應特異性的決定因素。延伸溫度：70?72C左右，為 Taq酶最適反應溫度。材料設備及試劑設備：eppendof管、微量取液器、臺式高速離心機、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、 PCR儀試劑：16SrDNA引物、細菌基因組DNATaqPlus、dNTRPCR沖液、瓊脂糖、TAE電極緩沖液、LamdarDNA/Hind川、染色液、 加樣緩沖液操作步驟PCR反應依次混勻下列試劑5Pl10XPCR反應緩沖液1P14種dNTP2Pl上游引物（引物1）2Pl下游引物（引物2）Pl模板DNA0.5PlTaqDNA聚合酶8.5PlH2O混勻后離心5秒。擴增：用94C變性3分鐘，94C變性1分鐘，61C退火1分鐘，72C延伸1分鐘，循環(huán)30輪,進行PCR最后一輪循環(huán)結束后，于72C下最后延伸5-10分鐘，使反應產物擴增充分。電泳檢測：1%瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產物電泳結果。.用試劑盒做瓊脂糖凝膠電泳分離和膠回收目的片段用TaKaRaDNA純化試劑盒對PCR擴增產物純化.純化后的目的片斷送到測序公司測序也可以直接將電泳檢測后的 PCR產物送到測序公司，讓公司對產物進行純化和測序.BLAST比對獲取相似片段。將測序得到的16SrDNA序列在NCBI上進行blast比對，選擇與比對序列相似度高的菌株。.構建系統(tǒng)進化樹將選擇的序列與測序序列用 DNAStar軟件的MegAlign構建菌株系統(tǒng)進化樹。-如果要測16SrDNA的全序列長度則需要對 PCR產物做T-A克隆。T-A克隆步驟：PCR口連接■轉化鑒定T-A克隆需要在PCR產物末端加A尾巴有些PCR聚合酶可以在產物末端加A尾巴，但并不是所有的聚合酶會加A尾巴，所以在克隆之前最好搞清楚使用的酶到底是否加A,否則克隆出來的白班太少，又要討論很久。具有3'到5'外切酶活性的高保真酶就不會產生A尾巴。產物末端加A步驟：用高保真酶擴增完之后，在反應管中加入 0.7-1unit的Tap聚合酶。無需更換buffer期中的dATP已經夠用。在72孵育8-10min。立即進行純化，沉淀、跑膠、或用純化試劑盒。這一點相當重要，否則高保真聚合酶會將A尾巴或T載體上的T尾巴切掉。將加A尾巴的PCR產物與T載體連接常用的T載體有Invitrogen的T載體；Promege的pGEM-T和TaKaRa的pMD18-T。將載體與目的片斷的連接產物轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中進行液體搖床培養(yǎng)，涂平板進行藍白斑挑選。對挑選的菌落提質粒，電泳檢測大小，對正確的陽性克隆的質粒進行酶切目的片斷回收。目前對于T-A克隆技可以通過T-A克隆試劑盒來完成。細菌16SrDNA鑒定是應注意的問題和常見問題1細胞裂解注意事項材料應適量，過多會影響裂解，導致 DNA量少，純度低選擇適當的裂解處理方式高溫溫浴室定時輕柔震蕩2核酸分離純化采用吸附材料吸附的方式分離 DNA時，應提供相應的緩沖體系。采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔。離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間。針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質的方法。3核酸沉淀、溶解當沉淀的時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分。沉淀是加入1/10體積的NaAc（PH523M），有利于充分沉淀。沉淀后應用70%勺乙醇洗滌，以除去鹽離子等。晾干DNA讓乙醇充分揮發(fā)。若長期儲存建議用TE緩沖液溶解;TE中的EDTA能螯合Mg2堿Mn2人離子抑制DNase,TE緩沖液PH8.0可以防止DNA發(fā)生酸解。DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和 PCR反應DNA中含有蛋白，多糖，多酚類雜質：應重新純化 DNA去除雜質。DNA在溶解前有酒精殘留,酒精抑制后續(xù)酶解反應：應重新沉淀 DNA讓酒精充分揮發(fā)。DNA中殘留有金屬離子：應增加70%乙醇的洗滌次數（2-3次）。DNA提取量少實驗材料不佳或量少：應盡量選擇新鮮的材料。破壁或裂解不充分：Gh菌裂解前應先用生物酶或機械方式破壁； 高溫裂解時，時間適當延長沉淀不完全：低溫沉淀，延長沉淀時間；加輔助物促進沉淀。洗滌DNA寸丟失：洗滌時最好用槍頭將洗滌液吸出,勿傾倒。DNA降解未很好的抑制內源核酸酶的活性：可增加裂解液中螯合劑的含量。提取過程操作過于劇烈, DNA被機械打斷：細胞裂解后的后續(xù)