常用的五種基因測序儀器的比較

4/5/2024生產計劃部常用的五種基因測序儀器的比較主要內容三代測序技術簡況五種測序儀器的原理和特性五種測序儀器的比較2以實驗方法和實驗儀器的改進為標志DNA測序技術迄今經歷了三代的發(fā)展代數(shù)測序技術特點代表儀器第一代sanger測序法低通量，高成本ABI3730XL第二代循環(huán)芯片技術高通量高效率成本底IlluminaGAROCH-454ABI-SOLID第三代單分子測序試劑用量少，成本更低HeliScope3一、測序儀之——ABI3730XLABI3730XL的測序原理

sanger法：毛細管電泳分離電腦熒光檢測數(shù)據(jù)分析可得到DNA堿基序列。42.ABI3730xl特性通過幾十年的逐步改進,ABI3730xl測序儀的讀長可以超過1000bp,原始數(shù)據(jù)的準確率可以高達99.999%測定每千堿基序列的成本是0.5美元,每天的數(shù)據(jù)通量可以達到600000堿基但是ABI3730xl測序技術在速度和成本方面都已達到了極限.由于其對電泳分離技術的依賴,使其難以進一步提升分析的速度,并且難以通過微型化降低測序成本.盡管如此,ABI3730xl的方法可靠、準確,且已形成規(guī)模化,特別是在PCR產物測序、質粒和細菌人工染色體的末端測序、以及STR基因分型方面,將繼續(xù)發(fā)揮重要作用.5二、測序儀之——ABISOLID

ABISOLID的測序原理：制備DNA文庫乳液PCR/微珠富集連接酶測序:SOLiD連接反應的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應中，這些探針按照堿基互補規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對。這樣經過五輪測序反應后便可以得到所有的堿基序列SOLID的雙堿基編碼矩陣6探針的5′末端標記了1種顏色的熒光染料。探針3′端1～5位為隨機堿基，其中第1、2位構成的堿基對表征探針染料類型，而3～5位的“n”為隨機堿基，6～8位的“z”是可以和任何堿基配對的特殊堿基。SOLiD測序反應的每一輪測序反應會連接第1~5位的堿基，同時切除第6~8位的堿基，同時記錄下第1~2位堿基決定的熒光顏色，7SOLID的雙堿基編碼矩陣兩個堿基共同決定一個顏色，可以極大的提高測序的準確率8五輪測序反應反應后，按照第0、1位，第1、2位...…的順序把對應于模板序列的顏色信息連起來，就得到由“0，1，2，3…”組成的SOLiD原始顏色序列。92.ABISOLID的特性無以倫比的通量目前SOLiD3系統(tǒng)單次運行能產生50GB的人基因組序列數(shù)據(jù)，相當于基因組的17倍覆蓋度，這顯然是其他任一臺新一代測序系統(tǒng)都無法達到的準確性。新的超精確檢測模塊（ECC模塊）將提供高達99.99%的精確性；多達98%的可定位堿基的質量值高于45；更多標簽以提高靈敏度和動態(tài)范圍；高準確性的原始讀序，支持無參考序列的數(shù)據(jù)分析。10三、測序儀之——IlluminaGenomeAnalyze

IlluminaGA的測序原理制備DNA文庫橋式PCR產生DNA簇測序

加入DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP。每個循環(huán)摻入單個堿基。用激光掃描反應板表面，讀取所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團化學切割，恢復3′端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，就可以得知每個模板DNA片段的序列。

11橋式PCR122.IlluminaGA的特性1.可擴展的超高通量

GenomeAnalyzer系統(tǒng)目前每次運行后可獲得超過20GB的高品質過濾數(shù)據(jù)。經優(yōu)化后通量還有望上升到95GB，相當于人類基因組的30倍覆蓋度。2.需要樣品量少

GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，能應用在很多樣品有限的實驗（比如免疫沉淀、顯微切割等）中。3.簡單、快速、自動化

GenomeAnalyzer系統(tǒng)提供了最簡單和簡潔的工作流程。制備樣品文庫可以在幾小時內完成，一個星期內就能得到高精確度的數(shù)據(jù)。自動化的流程不減少了手工操作誤差和污染可能性，也不需要機器人操作或潔凈室。13四、測序儀之——ROCH-454454測序原理及流程文庫制備乳液PCR擴增焦磷酸測序14乳液PCR擴增焦磷酸測序152.ROCH-454的優(yōu)勢454平臺的突出優(yōu)勢是讀長。目前454系統(tǒng)的序列讀長已超過400bp。雖然454平臺的測序成本比其他平臺要高很多，不過對于那些需要長讀長的應用，如從頭拼接和環(huán)境微生物組學，它仍是最理想的選擇。16五、測序儀之——HeliScope

HeliScope

的測序原理將基因組DNA切割成隨機的小片段DNA分子，并且在每個片段末端加上poly-A尾通過poly-A尾和固定在芯片上的poly-T雜交，將待測模板固定到芯片上，制成測序芯片最后借助聚合酶將熒光標記的單核苷酸摻入到引物上。采集熒光信號，切除熒光標記基團，進行下一輪測序反應，如此反復，最終獲得完整的序列信息。172.HeliScope

的優(yōu)勢

單分子測序減少了試劑的使用，測序成本價格大大降低，使得人的基因組測序低于1000美元慢慢走向可能。不需要擴增建立DNA庫，從而切斷數(shù)據(jù)結果中潛在錯誤的來源18五種測序儀器的比較由上表可以看出，第二代和第三代測序儀由于消耗的試劑少在測序費用上有了明顯的降低，但是在讀長上3730xl依然具有絕對的優(yōu)勢，不過隨著技術的完善，新一代的測序儀依然擁有極大的提升空間。19測序儀器所采用測序技術校錯方法高通量優(yōu)勢方面上市時間3730XL鳥槍Sanger測序法毛細管電泳技術

主要用于KB～MB級別的測序常規(guī)測序，高準確度2002年ABISOLiD

微乳液PCR擴增

連接酶法測序雙堿基編碼技術最高可達180GB第二代測序儀中準確度最高2007年1月SolexaGA橋式PCR技術

合成測序法通過質量優(yōu)化將錯誤率降低到0.1%可獲得超過20GB的高品質數(shù)據(jù)檢測同聚物2007年ROCH-454GSFLX大規(guī)模并行焦

磷酸合成測序法

每輪運行能獲得4-6億個堿基對超長的讀長400bp2005年HeliScope大規(guī)模并行單分子焦磷酸合成測序法重新以反方向再次測序目前測序讀長較短檢測堿基替換突變，費用低2008年2月20如何選擇合適的測序儀

測序的準確度和各自的優(yōu)勢的考慮：比如是善于發(fā)現(xiàn)插入、缺失突變還是善于發(fā)現(xiàn)堿基替換突變。

項目考量：比如重測序對于測序長度的要求沒有從頭測序的要求高；對于需要依靠標簽計數(shù)的測序項目，會更加需要能將待測片段分割成盡量多、盡量小片段的測序方法。