色譜分析法導(dǎo)論

關(guān)于色譜分析法導(dǎo)論2024/4/812024/4/821、色譜法的產(chǎn)生

色譜法是一種分離技術(shù)，它是俄國(guó)植物學(xué)家茨維特1906年創(chuàng)立的。分離植物葉子中的色素時(shí)，將葉片的石油醚（飽和烴混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3有吸附能力)，用純石油醚洗脫（淋洗）。一、色譜分析法簡(jiǎn)介第一節(jié)

概述

第2頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/83（1）CaCO3吸附，使色素在柱中停滯下來(lái)。（2）被石油醚溶解，使色素向下移動(dòng)各種色素結(jié)構(gòu)不同，受兩種作用力大小不同，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間洗脫后，色素在柱子上分開(kāi)，形成了各種顏色的譜帶，這種分離方法稱為色譜法。第3頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/84Tsweet的實(shí)驗(yàn)第4頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/85第5頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/86色譜法中共使用兩相固定相—固定不動(dòng)的相CaCO3

流動(dòng)相—推動(dòng)混合物流動(dòng)的液體石油醚色譜法：混合物在流動(dòng)相的攜帶下通過(guò)色譜柱分離出幾種組分的方法。

第6頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/87固定相：（1）固體吸附劑：CaCO3、Al2O3等（2）液體固定相（載體+固定液——高沸點(diǎn)有機(jī)化合物，涂在載體上）色譜分離法一定是先分離。后分析一定具有兩相；固定相和流動(dòng)相分離：利用組分在兩相中分配系數(shù)或吸附能力的差異進(jìn)行分離第7頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/88色譜法的特點(diǎn)“三高”、“一快”、“一廣”高選擇性——可將性質(zhì)相似的組分分開(kāi)高效能——反復(fù)多次利用組分性質(zhì)的差異產(chǎn)生很好分離效果高靈敏度——10-11~10-13g，適于痕量分析分析速度快——幾~幾十分鐘完成分離一次可以測(cè)多種樣品應(yīng)用范圍廣——?dú)怏w，液體、固體物質(zhì)化學(xué)衍生化再色譜分離、分析第8頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/89氣相色譜高效液相色譜薄層色譜紙色譜柱色譜經(jīng)典液相色譜法色譜－光譜聯(lián)用多維色譜智能色譜超臨界流體色譜毛細(xì)管電泳法2.色譜法的發(fā)展第9頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/810二、色譜分析法分類1、按兩相狀態(tài)分類氣相色譜—?dú)怏w作流動(dòng)相

（1）氣固色譜：氣體作流動(dòng)相，固體吸附劑作固定相。（2）氣液色譜：氣體作流動(dòng)相，固定液作固定相。第10頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/811液相色譜—液體作流動(dòng)相（1）液固色譜：液體作流動(dòng)相，固體吸附劑作固體相。（2）液液色譜：液體作流動(dòng)相，固定液作固定相。超臨界液體色譜——超臨界流體作色譜流動(dòng)相。

第11頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8122、按操作形式分類（1）柱色譜：填充柱色譜—固定相填充到柱管內(nèi)毛細(xì)管柱色譜—把固定相涂在毛細(xì)管內(nèi)壁上，中間是空的。（2）紙色譜：濾紙為固定相的色譜法，流動(dòng)相是含一定比例水的有機(jī)溶劑，樣品在濾紙上展開(kāi)進(jìn)行分離。（3）薄層色譜：把固體固定相壓成或涂成薄膜的色譜法。第12頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8133、按分離原理分類

固定相分離機(jī)制吸附色譜吸附劑吸附能力分配色譜液體分配系數(shù)或溶解度離子交換色譜離子交換劑交換能力或親和力分子排阻色譜凝膠或分子篩阻滯或滲透作用第13頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/814色譜與光譜的區(qū)別：色譜具有分離與分析兩種功能光譜沒(méi)有分離功能第14頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/815第二節(jié)色譜過(guò)程和基本原理

一、色譜過(guò)程

實(shí)現(xiàn)色譜操作的基本條件是必須具備相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相，固定相(stationaryphase)和流動(dòng)相(mobilephase)。

色譜過(guò)程是組分的分子在流動(dòng)相和固定相間多次“分配”的過(guò)程。第15頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/816二、色譜圖中的基本術(shù)語(yǔ)

1.色譜圖（chromatogram）

混合物樣品（A+B）→色譜柱中分離→檢測(cè)器→記錄下來(lái)。組分從色譜柱流出時(shí)，各個(gè)組分在檢測(cè)器上所產(chǎn)生的信號(hào)隨時(shí)間變化，所形成的曲線叫色譜圖。記錄了各個(gè)組分流出色譜柱的情況，又叫色譜流出曲線。（一）色譜流出曲線與色譜峰第16頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8172.基線（baseline）在實(shí)驗(yàn)操作條件下，色譜柱后沒(méi)有組分流出的曲線叫基線。穩(wěn)定情況下，一條直線?；€上下波動(dòng)稱為噪音。第17頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8183.色譜峰（peak）是流出曲線上的突起部分。正常色譜峰、拖尾峰和前延峰對(duì)稱因子fs

(symmetryfactor)：0.95~1.05對(duì)稱峰

<0.95前延峰

>1.05拖尾峰第18頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/819（二）色譜保留值——定性的依據(jù)

組分在色譜柱中停留的數(shù)值，可用時(shí)間t和所消耗流動(dòng)相的體積來(lái)表示。組分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越強(qiáng)，在柱中滯留的時(shí)間越長(zhǎng)，消耗的流動(dòng)相體積越大，固定相、流動(dòng)相固定，條件一定時(shí)，組分的保留值是個(gè)定值。第19頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8201.死時(shí)間(deadtime)

t0——不被固定相吸附或溶解的組分流經(jīng)色譜柱所需的時(shí)間。第20頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8212.保留時(shí)間tR(retentiontime)組分流經(jīng)色譜柱時(shí)所需時(shí)間。進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)最大值時(shí)所需的時(shí)間。操作條件不變時(shí)，一種組分有一個(gè)tR定值，定性參數(shù)。第21頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8223.調(diào)整保留時(shí)間t’R(adjustedretentiontime)—扣除了死時(shí)間的保留時(shí)間。t’R=tR-t0又稱校正保留時(shí)間，實(shí)際保留時(shí)間。

t’R體現(xiàn)的是組分在柱中被吸附或溶解的時(shí)間。

t’R第22頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8234.保留體積VR(retentionvolumn)-從進(jìn)樣開(kāi)始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)，所需通過(guò)色譜柱的流動(dòng)相體積。

5.死體積V0（deadvolumn）—不被固定相滯留的組分流經(jīng)色譜柱所消耗的流動(dòng)相體積稱死體積，色譜柱中載氣所占的體積。

第23頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8246.調(diào)整保留體積

(adjustedretention volume)：由保留體積扣除死體積后的體積7.相對(duì)保留值r(relativeretention)：兩組分的調(diào)整保留值之比注意：VR’是定值，tR’與FC成反比第24頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8251.色譜峰的高度h(peakheight)-色譜峰最高點(diǎn)與基線之間的距離，可用mm,mV，mA表示。峰高低與組分濃度有關(guān)，峰越高越窄越好。

(三)定量參數(shù)第25頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/826

2.色譜峰面積A（peakarea）

——色譜峰與基線所圍的面積。對(duì)于對(duì)稱的色譜峰A=1.065hW1/2對(duì)于非對(duì)稱的色譜峰

A=1.065h(W0.15+W0.85)/2

第26頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/827峰寬W（peakwidth）—色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)所作切線在基線上的距離W

=4σ

半峰寬W1/2(peakwidthathalfheight)—峰高一半處色譜峰的寬度W1/2

=2.354σW

=1.699W1/2標(biāo)準(zhǔn)偏差σ(standarddeviation)—峰高0.607倍處的色譜峰寬的一半。(四)區(qū)域?qū)挾鹊?7頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/828第28頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/829(五)分離度(resolution；R)：又稱分辨率。是相鄰兩色 譜峰保留時(shí)間之差與兩色譜峰峰寬均值之比。第29頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/830★定量分析時(shí)，要求R≥1.5分離度R分離程度分離情況0.889％未分離198％基本分離1.599.7％完全分離第30頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/831第31頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/832三、分配平衡在一定溫度下，組分在流動(dòng)相和固定相之間所達(dá)到的平衡叫分配平衡，組分在兩相中的分配行為常采用分配系數(shù)K和容量因子k來(lái)表示。

=cs/cm組分在固定相中的濃度組分在流動(dòng)相中的濃度K=1、分配系數(shù)K(distributioncoefficient)第32頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/833影響分配系數(shù)的因素：★組分的性質(zhì)★固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)★溫度：T越大，K越小第33頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/834★

K越大，Cs越大，在柱中停留的時(shí)間越長(zhǎng)，組分就后流出色譜柱；★

K越小，Cs越小，在柱中停留的時(shí)間越短，組分就先流出色譜柱。

★

K=0，組分不被固定相保留，最先流出?；旌衔镏懈鹘M分的K相差越大，就越容易分離。第34頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8352、容量因子k(capacityfactor)組分在固定相中的質(zhì)量組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量=ms/mm=Kvs/vm

k=k隨T、固定相、流動(dòng)相的體積變化而變化k越大，組分在固定相中質(zhì)量越多，tR越長(zhǎng)K、k越大，組分在固定相中tR就越長(zhǎng)第35頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/836★

色譜法的分離原理主要是利用物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相中K的差異而分離?！喾蛛x的前提：K不等。要求組分間必須有差速遷移，即tR不等。第36頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/837第三節(jié)色譜法的基本理論

一、塔板理論

在50年代，色譜技術(shù)發(fā)展的初期，Martin等人把色譜分離過(guò)程比作分餾過(guò)程，并把分餾中的半經(jīng)驗(yàn)理論－塔板理論用于色譜分析法。第37頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/838分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點(diǎn)不同而分離。色譜柱：組分在兩相間的多次分配平衡，按分配系數(shù)不同而分離。第38頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/839塔板理論假定：①在色譜柱內(nèi)每一“塔板”H內(nèi)，組分在兩相間瞬間達(dá)到分配平衡。②流動(dòng)相間歇式進(jìn)入色譜柱，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。③分配系數(shù)在各塔板內(nèi)是常數(shù)。④縱向擴(kuò)散可以忽略。第39頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/840（一）質(zhì)量分配和轉(zhuǎn)移1、單一組分B（kB=0.5）的分配和轉(zhuǎn)移

①設(shè)色譜柱的塔板數(shù)n=5，即r=0、1、2、3、4（或n-1）號(hào)。

②將單位質(zhì)量的B加到第0號(hào)塔板上。

③分配平衡后，0號(hào)塔板內(nèi)ms/mm＝ 0.333/0.667。

④進(jìn)入一個(gè)塔板體積的流動(dòng)相（一次轉(zhuǎn)移），第40頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/841第41頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/842經(jīng)過(guò)N次轉(zhuǎn)移后，質(zhì)量分布符合二項(xiàng)式(ms+mm)N的展開(kāi)式。如N=3，展開(kāi)式為：(0.333+0.667)3=0.037+0.222+0.444+0.296 0123號(hào)在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量分布由k(K)決定第42頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/843轉(zhuǎn)移N次后，第r號(hào)塔板中的質(zhì)量Nmr：

第43頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/844例：轉(zhuǎn)移3次后，在第2號(hào)塔板內(nèi)的溶 質(zhì)分?jǐn)?shù)第44頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/845組分B(kB=0.5)在n=5的色譜柱內(nèi)及出口的分布

Nr01234柱出口010000010.3330.667000020.1110.4440.44500030.0370.2220.4440.2960040.0120.0990.2690.3950.1980

50.0040.0410.1640.3290.3290.132

60.0010.0160.0820.2190.3290.219

700.0060.0380.1280.2560.219800.0020.0170.0680.1700.1709000.0070.0330.1020.11410000.0020.0160.0560.068第45頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/846注意：1、柱出口處的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算。2、質(zhì)量（濃度）最大點(diǎn)的N，即保留體積。第46頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8472、兩組分的分離A(kA=1)和B(kB=0.5)兩組分第47頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/848組分A(kA=1)在n=5的色譜柱內(nèi)和出口的分布

Nr01234柱出口010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.2500.3750.2500.0630

50.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1650.2740.2740.118

80.0040.0320.1110.2200.2740.137

90.0020.0180.0720.1660.2470.137100.0010.0100.0450.0940.2070.124第48頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/849結(jié)果：組分B:k=0.5,當(dāng)N=6和7時(shí)，柱出口產(chǎn)生B的濃度最大點(diǎn)。組分A：k=1，N=8和9時(shí)，柱出口處達(dá)到濃度最大點(diǎn)。兩組分開(kāi)始分離，k小的組分B在柱后先出現(xiàn)濃度極大值,即先出柱。第49頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/850一根色譜柱n=103以上，組分有微小的分配系數(shù)(容量因子)差別即可實(shí)現(xiàn)完全分離。 分配系數(shù)(容量因子)不等是分離的前提。第50頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/851

(二)流出曲線方程

1、二項(xiàng)式分布曲線 以組分A在柱出口處的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)N作圖。第51頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/852N柱出口0010203040

5

0.03260.07970.118

80.13790.137100.124

k=1的組分從n=5色譜柱中的流出曲線圖第52頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8532、色譜流出曲線當(dāng)塔板數(shù)很大時(shí)，流出曲線趨于正態(tài)分布曲線。第53頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/854第54頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/8553、色譜流出曲線方程（正態(tài)分布方程） 描述組分流出色譜柱的濃度變化：

為標(biāo)準(zhǔn)差，tR為保留時(shí)間，C為任意時(shí)間t時(shí)的濃度，C0為峰面積A，即相當(dāng)于某組分的總量。第55頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/856t=tR時(shí)，C有極大值：Cmax即流出曲線的峰高h(yuǎn)。σ一定時(shí)，峰高h(yuǎn)取決于C0。C0一定時(shí)，峰高h(yuǎn)取決于σ。第56頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/857流出曲線方程的常用形式：不論t＞tR或t＜tR時(shí)，濃度C恒小于Cmax。C隨時(shí)間t向峰兩側(cè)對(duì)稱下降。σ越小，峰越銳。σ是柱效的標(biāo)志。第57頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/858色譜峰面積以A代替C0，h代替Cmax，且W1/2=2.355σ，峰面積:A=h

σ(2

π)1/2A=1.065×W1/2×h

色譜定量的參數(shù)第58頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/859(三)理論塔板高度和理論塔板數(shù)

(heightequivalenttoatheoretical plate或plateheight,H) (platenumber,n)

是色譜柱效參數(shù)。第59頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/860理論塔板數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差（峰寬或半峰寬）和保留時(shí)間的關(guān)系：第60頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/861理論塔板高度

H=L/n

注意：1、計(jì)算n時(shí)使標(biāo)準(zhǔn)差（峰寬或半峰寬）和保留時(shí)間單位一致

2、n的單位第61頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/862有效理論塔板數(shù)和有效理論塔板高度Hef=L/nef第62頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/863注意：★用nef和Hef作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)?！锂?dāng)兩組分的K相同時(shí)，無(wú)論該色譜柱的n多大，都無(wú)法分離。第63頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/864存在問(wèn)題:★做出的四個(gè)假設(shè)與實(shí)際不符，忽略了組分在兩相中傳質(zhì)和擴(kuò)散的動(dòng)力學(xué)過(guò)程?！镏荒芏ㄐ越o出塔板高度的概念，無(wú)法解釋板高的影響因素。★排除了一個(gè)重要參數(shù)——流動(dòng)相的線速度u，因而無(wú)法解釋柱效與流速關(guān)系。第64頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/865二、速率理論——?jiǎng)恿W(xué)觀點(diǎn)VanDeemteer方程式：渦流擴(kuò)散項(xiàng)縱向擴(kuò)散項(xiàng)傳質(zhì)阻力項(xiàng)載氣線流速(cm·s-1)u＝柱長(zhǎng)L(cm)/死時(shí)間t0(s)理論塔板高度

(cm)u一定，A、B、C小，H小，柱效n高，峰尖銳第65頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/866（1）渦流擴(kuò)散項(xiàng)A當(dāng)組分隨流動(dòng)相向柱出口遷移時(shí)，流動(dòng)相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動(dòng)方向，使組分分子在前進(jìn)中形成紊亂的類似“渦流”的流動(dòng)（路徑不同）→不能同時(shí)流出色譜柱（色譜峰擴(kuò)張），故稱渦流擴(kuò)散。第66頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/867通常選粒度為60~100目的填充顆粒，并盡量填充均勻。但dp不能太小，否則不易填充均勻（λ大），且阻力（柱壓）也大。填充不規(guī)則因子填充物顆粒的平均直徑渦流擴(kuò)散系數(shù)第67頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/868待測(cè)組分是以“塞子”的形式被流動(dòng)相帶入色譜柱的，在“塞子”前后存在濃度梯度，由濃→稀方向擴(kuò)散，產(chǎn)生了縱向擴(kuò)散，使色譜峰展寬。（2）分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u（縱向擴(kuò)散項(xiàng)）

第68頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/869（2）分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u（縱向擴(kuò)散項(xiàng)）

氣體擴(kuò)散路徑彎曲因子組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)縱向擴(kuò)散系數(shù)組分在固定相中的擴(kuò)散很小，可忽略第69頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日，星期天2024/4/870分子量↑柱溫↓柱壓↑B↓Dg↓tR↓（u↑）↓填充物B/u↓柱效↑H↓（n↑）填充柱＜1硅藻土擔(dān)體0.5～0.7毛細(xì)管柱＝1

減小縱向擴(kuò)散項(xiàng)Ｂ／u采取措施：第70頁(yè),共77頁(yè)，2024年2月25日