酵母基因工程

關于酵母基因工程A酵母菌作為表達外源基因受體菌的特征酵母菌的分類學特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔子菌綱（擔子酵母菌）、半知菌類（半知酵母菌），共由56個屬和500多個種組成。如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達系統(tǒng)。第2頁,共40頁，2024年2月25日，星期天A酵母菌作為表達外源基因受體菌的特征酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基中具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產內毒素，美國FDA認定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）酵母菌是最簡單的真核模式生物第3頁,共40頁，2024年2月25日，星期天B酵母菌的宿主系統(tǒng)提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌抑制超糖基化作用的突變宿主菌減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌廣泛用于外源基因表達的酵母宿主菌第4頁,共40頁，2024年2月25日，星期天廣泛用于外源基因表達的酵母宿主菌目前已廣泛用于外源基因表達和研究的酵母菌包括：酵母屬如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克魯維酵母屬如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母屬如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）漢遜酵母屬如多態(tài)漢遜酵母（Hansenulapolymorpha）其中釀酒酵母的遺傳學和分子生物學研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達外源基因最理想。第5頁,共40頁，2024年2月25日，星期天提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌能導致釀酒酵母中重組蛋白產量提高或質量改善的突變類型ssc1

改善重組蛋白分泌鈣離子依賴型的ATP酶ssc2

提高重組蛋白表達轉錄后加工rgr1

提高重組蛋白表達轉錄水平ose1

提高重組蛋白表達轉錄水平ssc11

改善重組蛋白分泌羧肽酶Yrho-

提高重組蛋白表達轉錄水平突變類型生物效應作用位點第6頁,共40頁，2024年2月25日，星期天抑制超糖基化作用的突變宿主菌能抑制超糖基化的突變類型mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天門冬酰胺側鏈糖基化缺陷型och外側糖鏈添加缺陷型突變類型生物效應許多真核生物的蛋白質在其天門冬酰胺側鏈上接有寡糖基團，它們常常影響蛋白質的生物活性。整個糖單位由糖基核心和外側糖鏈兩部分組成。

酵母菌普遍擁有蛋白質的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對異源蛋白的糖基化反應很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。第7頁,共40頁，2024年2月25日，星期天減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素介導的蛋白質降解作用蛋白酶體LysHOOCUbiquitin76aa

ubiquitinligaseE3

LysubiquitinligaseE3

Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白第8頁,共40頁，2024年2月25日，星期天減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因酵母菌共有四個泛素編碼基因：UBI1

編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對數生長期表達穩(wěn)定期關閉UBI2

編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對數生長期表達穩(wěn)定期關閉UBI3

編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）對數生長期表達穩(wěn)定期關閉UBI4

編碼泛素五聚體對數生長期關閉穩(wěn)定期表達酵母菌共有七個泛素連接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7第9頁,共40頁，2024年2月25日，星期天減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素降解途徑衰減的釀酒酵母在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表達，UBI4-突變株能UBI4缺陷型：正常生長，但細胞內游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，因此UBI4缺陷突變株是外源基因表達理想的受體UBA1缺陷型：UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導的蛋白降解Ubc4-ubc5雙突變型：七個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效第10頁,共40頁，2024年2月25日，星期天C酵母菌的載體系統(tǒng)酵母菌克隆表達質粒的構建酵母菌中的野生型質粒第11頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌中的野生型質粒釀酒酵母中的2m環(huán)狀質粒幾乎所有的釀酒酵母中都含有2m雙鏈同源重組REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB環(huán)狀質粒，拷貝數達50至100個。IRs反向重復序列，600bp，重組FLP

編碼產物驅動IRs的同源重組REP

編碼產物控制質粒的穩(wěn)定性STB

REP的結合位點接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中的pKD1等均與2m質粒類似。第12頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌中的野生型質粒乳酸克魯維酵母中的線狀質粒乳酸克魯維酵母中含有兩種不同pGKL18.9kbDNA聚合酶毒素蛋白ab免疫蛋白g亞基的雙鏈線狀質粒pGKL1和pGKL2拷貝數為50-100個，分別攜帶K1K2兩種能使多種酵母菌致死的毒反向重復序列素蛋白編碼基因（abg），同時含有毒素蛋白抗性基因。第13頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌克隆表達質粒的構建含有ARS的YRp質粒的構建ARS為酵母菌中的自主復制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個ARS元件。酵母菌自主復制型質粒的構建組成包括復制子、標記基因、提供克隆位點的大腸桿菌質粒DNA。

以ARS為復制子的質粒稱為YRp上述兩類質粒在釀酒酵母中的拷貝數最高可達200個，但培養(yǎng)幾代

以2m質粒上的復制元件為復制子的質粒稱為YEp后，質粒的丟失率高達50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。第14頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌克隆表達質粒的構建含有CEN的YCp質粒的構建CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關的序列將CENDNA插入含ARS的質粒中，獲得的新載體稱為YCpYCp質粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數只有1-5個第15頁,共40頁，2024年2月25日，星期天利用酵母菌的端粒TEL、CEN和ARS等DNA元件構建人工酵母染色體，可以克隆擴增大片段的外源DNA，這是YAC載體構建的基本思路。這類載體一個典型的例子是pYAC2，它除了裝有兩個方向相反的TELDNA片段外，還包括SUP4、TRP1和URA3等酵母菌選擇基因以及大腸桿菌的復制子和選擇基因Ap。SUP4編碼tRNATyr的赭石抑制tRNA，在ade2基因赭石突變株中，SUP4基因的表達使轉化子呈白色，而非轉化子或SUP4基因不表達時呈紅色，因此將外源DNA克隆在YAC載體的SmaI位點上，便可滅活SUP4基因，獲得紅色的重組克隆。pYAC2上的大腸桿菌元件主要是為了載體質粒在大腸桿菌中的擴增與制備。YAC載體的裝載量可高達800Kb，因而非常適用于構建人的基因文庫。含有TEL的YAC質粒的構建r第16頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌克隆表達質粒的構建含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質粒的構建

在大腸桿菌質粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標記基因，構建出來的質粒稱為Yip。目的基因表達盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域第17頁,共40頁，2024年2月25日，星期天D酵母菌的轉化系統(tǒng)轉化質粒在酵母細胞中的命運酵母菌的轉化程序用于轉化子篩選的標記基因第18頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌的轉化程序酵母菌原生質體轉化法

早期酵母菌的轉化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質體轉化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉化細胞可達原生質體總數的1-2%。但該程序操作周期長，而且轉化效率受到原生質再生率的嚴重制約原生質體轉化法的一個顯著特點是，一個受體細胞可同時接納多個質粒分子，而且這種共轉化的原生質體占轉化子總數的25-33%第19頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌的轉化程序堿金屬離子介導的酵母菌完整細胞的轉化

釀酒酵母的完整細胞經堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質粒DNA，而且具有下列特性：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍共轉化現象極為罕見第20頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌的轉化程序酵母菌電擊轉化法酵母菌原生質體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質粒DNA，但在此過程中應避免使用PEG，它對受電擊的細胞具有較很大的負作用。電擊轉化的優(yōu)點是不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉化率可高達105/mgDNA。第21頁,共40頁，2024年2月25日，星期天轉化質粒在酵母細胞中的命運單雙鏈DNA均可轉化酵母菌，但單鏈的轉化率是雙鏈的10-30倍含有復制子的單鏈質粒進入細胞后，能準確地轉化為雙鏈并復制不含復制子的單鏈質粒進入細胞后，能高效地同源整合入染色體這對于體內定點突變酵母基因組極為有利克隆在YIp整合型質粒上的外源基因，如果含有受體細胞的染色體DNA的同源序列，會發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉化子總數的50-80%第22頁,共40頁，2024年2月25日，星期天用于轉化子篩選的標記基因用于酵母菌轉化子篩選的標記基因主要有營養(yǎng)缺陷型互補基因和顯性基因兩大類

營養(yǎng)缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE

但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難營養(yǎng)缺陷型的互補基因第23頁,共40頁，2024年2月25日，星期天用于轉化子篩選的標記基因顯性標記基因的編碼產物只要是毒性物質的抗性蛋白顯性標記基因aph

氨基糖苷轉移酶抗G418cat

氯霉素乙酰轉移酶抗氯霉素dhfr

二氫葉酸還原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1

銅離子螯合物耐受銅離子suc2

蔗糖轉化酶耐受高濃度蔗糖ilv2

乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草劑標記基因編碼產物遺傳表型第24頁,共40頁，2024年2月25日，星期天E酵母菌的表達系統(tǒng)外源基因在酵母菌中表達的限制因素酵母菌啟動子的可控性酵母菌表達系統(tǒng)的選擇第25頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌啟動子的可控性pho4TS-PHO5啟動子：釀酒酵母PHO5啟動子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時才能打開。PHO4基因編碼產物是PHO5啟動子的正調控因子。因此，裝在pho4TS-PHO5啟動子下游的外源基因在35℃時關閉23℃誘導表達溫度控制型啟動子PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產物在35℃時失活第26頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌啟動子的可控性釀酒酵母超誘導型啟動子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導效果不明顯，基因基底水平表達GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導時，GAL4高效表達，GAL1、GAL1、GAL10超高效表達GAL10Promoter的半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和

GAL10基因編碼第27頁,共40頁，2024年2月25日，星期天外源基因在酵母菌中表達的限制因素外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對密碼子的偏愛性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個密碼子編碼的第28頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌表達系統(tǒng)的選擇釀酒酵母的基因表達系統(tǒng)最為成熟，包括轉錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫釀酒酵母表達系統(tǒng)酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達。釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達系統(tǒng)來彌補。第29頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌表達系統(tǒng)的選擇

乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產的高效表達穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng)能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達系統(tǒng)。第30頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌表達系統(tǒng)的選擇巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)長，甲醇可高效誘導甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達，因此生長迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子、表達的可誘導性是巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的三大優(yōu)勢。由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復制型載體，所以外源基因的表達序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下，外源基因具有經濟價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達。的高效表達在很大程度上取決于整合拷貝數的多寡。目前已有20余種第31頁,共40頁，2024年2月25日，星期天酵母菌表達系統(tǒng)的選擇多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復制序列HARS已被多型漢遜酵母表達系統(tǒng)克隆，并用于構建克隆表達載體，但與巴斯德畢赤酵母相似，這種載體在受體細胞有絲分裂時顯示出不穩(wěn)定性。所不同的是，HARS質粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上，甚至可以連續(xù)整合100多目前，包括乙型肝炎表面抗原在內的數種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲個拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構建也是采取整合的策略。得成功表達。第32頁,共40頁，2024年2月25日，星期天F利用重組酵母生產乙肝疫苗由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴重的傳染病，每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當一部分人可能轉化為肝硬化或肝癌患者。目前對乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產對預防病毒感染具有重大的社會效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產乙型疫苗為其廣泛應用提供了可靠的保證。第33頁,共40頁，2024年2月25日，星期天F利用重組酵母生產乙肝疫苗產乙肝表面抗原的重組釀酒酵母乙型肝炎病毒的結構與性質產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母第34頁,共40頁，2024年2月25日，星期天乙型肝炎病毒的結構與性質

乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，具有感染力的病毒乙型肝炎病毒的結構顆粒呈球面狀，直徑為42nm，基因組僅為3.2kb。病毒顆粒的主要結構蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的22病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的1000倍。包裝蛋白共有三種轉膜糖蛋白：S、M、L多肽。第35頁,共40頁，2024年2月25日，星期天乙型肝炎病毒的